Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы
Summary
Рекомбинантный адено-связанный вирус (rAAVs) векторов, становятся все более ценными для<em> В естественных условиях</em> Исследования на животных. Мы опишем, как rAAVs могут быть произведены в лаборатории, и как эти векторы могут быть оттитрованы, чтобы дать точное считывание количества инфекционных частиц.
Abstract
В последние годы рекомбинантный адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных, а также в настоящее время проходит испытания в клинические испытания на человеке. Дикого типа AAV является непатогенных члена семьи parvoviridae и по своей сути репликации с дефицитом. Широкого профиля трансдукции, низкий иммунный ответ, а также сильных и устойчивых экспрессии трансгена достигнуты с этими векторами сделало их популярными и универсальный инструмент для в пробирке и в естественных условиях доставки гена. rAAVs можно легко и дешево производится в лаборатории, и, основываясь на их благоприятный профиль безопасности, которые обычно предоставляются низкой классификации безопасности. Здесь мы опишем метод производства и titering химерных rAAVs содержащие белки капсида, так и AAV1 AAV2. Использование этих так называемых химерного вектора сочетает в себе преимущества обоих родительских серотипов, таких как высокие запасы титры (AAV1) и очисткис помощью аффинной хроматографии (AAV2). Эти AAV серотипов являются наиболее изученным из всех серотипов AAV, и в индивидуальном порядке имеют широкую картину инфекционности. Химерного вектора, описанные здесь, должны иметь инфекционные свойства AAV1 и AAV2 и, таким образом, можно ожидать, чтобы заразить широкий спектр тканей, включая нейроны, скелетных мышцах, поджелудочной железы, почек и других. Метод, описанный здесь используется гепарин очистки колонки, метод считается, дают более высокий титр вирусных и чище вирусных подготовки, чем другие методы очистки, такие как центрифугирование через цезия градиентом хлорида. Кроме того, мы опишем, как эти векторы могут быть быстро и легко оттитрованы, чтобы дать точное считывание количества инфекционных частиц.
Protocol
Discussion
rAAV векторы становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных. Здесь мы описали простой и недорогой протокол для производства rAAVs, которые могут способствовать широкому применению этого полезного вектор, избегая дорогостоящих услуг сторонних вируса продукции компании. Протокол (на основе справочных 1) описывает производство химерных rAAV1 / 2 векторов, содержащих белки капсида от обоих родительских серотипов при равном соотношении 4. Очистка rAAV векторов путем связывания с гепарином колонн опирается на выражение AAV2 капсид белков, но могут быть объединены с другими серотипами, чем AAV1 изложены здесь. Кроме того, AAV6, как сообщается, связываться с гепарином, хотя и с пониженным сродством, и потенциально может быть очищен с гепарином столбцов с помощью этой процедуры 5,6. Следует отметить, однако, что другие серотипы потребует различных концентраций NaCl для элюирования колонки гепарин 5,7.
Упаковка rAAV геномов было показано, что оптимальное между 4,1 и 4,9 кб с резким сокращением в упаковке КПД до 5,2 кб 8. Эта упаковка предел может считаться крупнейшим недостатком системы rAAV, так как тип клеток-специфического регулирования экспрессии трансгена обычно достигается за счет большого цис-действующих элементов, которые не могут быть удовлетворены за счет мелких частиц AAV. Чтобы преодолеть низкий титр партий, например, в результате попытки пакета генов, которые близки к пределу AAV упаковки мы объединяем отдельные вирусные партиях сосредоточено до 250 мкл в 500 мкл одна партия, а не добавлять PBS как указано в пункте 6.3. Надежная камерного типа конкретных трансдукции может быть достигнуто за счет Cre-драйвера мыши и условных кассеты rAAV (см. ниже), чтобы избежать растяжения упаковки предела.
Следует отметить, что в то время как этот протокол попытки обеспечить легкий в следуйте инструкциям на производство высококачественных тИТЭР rAAV, он требует наличия AAV2 капсида фрагментов белка для очистки гепарин аффинной хроматографии. Серотипов, кроме AAV2 должна быть очищена с помощью альтернативных процедур 9. Одним из преимуществ гепарин очистки столбец считается, производить AAV векторов, которые имеют большую инфекционности темпами, чем, полученной с использованием градиента цезия хлорид 10. Тем не менее, Есть также некоторые недостатки этого метода. Например, другие белки, которые связывают гепарин может также присутствовать в очищенной вирусной акции. Хотя тропизм гепарин-очищенных векторы могут влиять на вектор титр 10, наш подход к конкретно нацелены либо возбуждающих 20 или тормозных нейронов (рис. 2) работает Cre-индуцированной активации AAV-опосредованной экспрессии трансгена и титр-независимыми. Альтернативу гепарину очистки колонка использование iodixanol градиента плотности, которая производит более высокий титр вирусных и чище, чем подготовка использованиецезия градиентом хлорида 10. Этот метод может также сочетаться с гепарином очистки колонке для получения вектора, который больше, чем 99% чистого 11. Таким образом, серьезное внимание должны быть приняты отдельными группами, какие вирусные метод очистки лучше всего подходит для их конкретных приложений вниз по течению.
Наиболее распространенные проблемы, связанные с этим протоколом низкий вирусный титр. По нашему опыту это, как правило, восходят к низкой эффективности трансфекции, или элюирования вируса из гепарин столбцов. Все трансфекции материалы должны быть при комнатной температуре до трансфекции, и проверить трансфекции должны быть выполнены, чтобы найти оптимальные условия в каждой лаборатории. Другие методы трансфекции, таких как lipofectamine, отличаются высокой эффективностью, но может быть слишком дорого. Кроме того, концентрации и рН гепарин решения элюирования колонка имеет решающее значение для полного вымывания вирионов из гепарина witho столбцовут повреждения. Еще одним важным моментом является то, что упаковка клетки должны хорошо прилипают к поверхности блюда тканевой культуры. Если клетки отделяются на определенном этапе во время процедуры рекомендуется прекратить эксперимент и размораживания новый флакон клеток.
Пространственно-временной контроль экспрессии трансгена у грызунов легко достигается точной ориентации анатомических и стадии развития животного. Эффективное AAV-опосредованного переноса генов было показано внутриутробно 12,13. Во взрослом мозге, площадь инфицированных rAAV частиц после стереотаксической инъекции можно регулировать от очень маленьких целевых регионах, гораздо больших площадях не только изменениями в вирусном титре, но и путем изменения параметров впрыска. К ним относятся объем и скорость инъекции, а также включение полиола маннитол с вирусной суспензии 14. Маннитол также может быть использован для повышения заражения различных тканей после системной инъекции rAAV 15 </ SUP>.
Упаковке мощностью rAAV (примерно 4,7 кб), вероятно, наиболее ограничивающим фактором с точки зрения генов, которые могут быть выражены в этих вирусных векторов. Однако, недавние исследования показали, что это может быть частично преодолены путем расщепления больших генов или выражение кассеты на отдельные векторы rAAV и введение моста последовательности, инициируя экспрессию генов, когда вирионы заразить той же клетке 16. Выражение уровне генов, переносимых насекомыми, rAAV также может быть значительно повышена с помощью самостоятельного бесплатный rAAV векторов 17. Стереотаксической инъекции векторов rAAV обеспечивает быстрый, недорогой и мощный метод для стимуляции экспрессии генов в регионе имеет свои особенности. В сочетании с 2-го поколения стратегии РНК-интерференции 18 rAAVs также может быть использован для конкретного региона генов сбить. rAAVs могут быть объединены с Cre-трансгенных мышей или камерного типа конкретных промоутеров для достижения схемы и камерного типа-Специфическая экспрессия генов, позволяющих генетические манипуляции с высоким пространственным разрешением 2,19-21, при монтаже rAAVs, например, с системой тет добавляет временной контроль над вирусом-опосредованной экспрессии генов 22,23. Эти примеры иллюстрируют огромное комбинаторное потенциал этих векторов и прогнозировать быстрый рост rAAV основе исследований за долгие годы.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American type culture collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
Table 1. Specific reagents required for protocol
Riferimenti
- Klugmann, M. AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats. Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).
- Murray, A. J. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).
- Hauck, B. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).
- Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors. Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).
- Blankinship, M. J. Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).
- Wu, Z. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).
- Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).
- Zolotukhin, S. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods. 1, 158-167 (2002).
- Burova, E., Loffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).
- Bilbao, R. Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1. Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).
- Mastakov, M. Y. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).
- Fu, H. Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain. Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).
- Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences. Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).
- Georgiadis, A. AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins. Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).
- Atasoy, D. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Guggenhuber, S. AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity. PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).
- Lawlor, P. A. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).
- Chtarto, A. Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).
- Han, Y. Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors. Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).
