Produzione e titolazione di vettori virali ricombinanti adeno-associato

Vedere la Figura 1 per un esempio che riassume il seguente protocollo. Nota di sicurezza: Tutto il materiale che è stato in contatto con particelle virali assemblato deve essere disinfettata con soluzione disinfettante Virkon o altro idoneo. 1. La preparazione delle scorte DNA plasmidico (~ 2 giorni) I plasmidi sono necessari i seguenti 1: pRV1 – contenenti la Rep AAV2 e sequenze Cap PH21 – contenenti il ​​AAV1 Rep e le sequenze Cap pFdelta6 – Adenovirus-helper plasmide Plasmide contenente la cassetta AAV ricombinante espressione affiancato da AAV2 segnali imballaggio (ripetizioni terminali invertite, ITRS) Mentre pFdelta6 dovrebbero essere coltivate in Stbl2 cellule competenti per impedire la cancellazione parziale, pRV1 e PH21 può essere coltivata in cellule DH5alpha competenti. Plasmidi AAV può essere coltivata in cellule Stbl2 se delezioni parziali si verificano nelle cellule DH5alpha. DNA plasmidico deve essere di alta qualità e privo di contaminanti RNA. Plasmidi possono essere sottoposti a screening per l'integrità utilizzando i seguenti riassunti: pRV1 – digerire con XbaI per dare bande di 7,5 kb e 3,8 kb PH21 – digestione con EcoRI per dare bande di 4,5 kb, 2,8 kb e 0,2 kb pFdelta6 – digerire con HindIII per dare bande di 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2.3 kb e 1,5 kb 2. Preparazione di cellule embrionali umane del rene 293 (HEK293) per trasfezione (2 – 3 giorni) Piastra di due 80% confluenti 150 centimetri due fiaschi di cellule HEK293 15 centimetri in cinque piatti del tessuto diametro cultura Nunc. Le cellule devono essere 70 – 80% confluenti prima trasfezione (circa 48 ore dopo placcatura). Cellule in coltura standard di Dulbecco modificato (DMEM) con glucosio contenente il 10% di siero fetale bovino e 100 U / ml di penicillina / 100 mg / ml di streptomicina. 3 ore prima della trasfezione rimuovere e sostituire con DMEM Iscove'Medium s modificato Dulbecco (IMDM) contenente 5% di siero fetale bovino. 3. Trasfezione di plasmidi virali (~ 1 ora per la trasfezione, 3 giorni di incubazione) Preparare la seguente per un singolo lotto (5 x 15 cm piastre di coltura dei tessuti) di virus: 62,5 mcg plasmide AAV 125 mcg pFdelta6 31,25 mg pRV1 31,25 mg PH21 1650 microlitri 2,5 M CaCl 2 12 ml dH 2 O In un filtro 2 classe cappuccio coltura tissutale sterile la miscela di trasfezione in una provetta da 50 ml. Vortex, mentre la soluzione, aggiungere rapidamente 13 ml di 2 HEPES x salina tamponata (pH 7,05). Sostituire il coperchio del tubo da 50 ml e continuare a vortex per 15 secondi. Lasciare riposare per 1 minuto 45 secondi, un precipitato fine e bianca dovrebbe formare. Delicatamente aggiungere 5 ml di soluzione di trasfezione per ogni piatto 15 colture di tessuti cm. Piastre agitare e tornare alla incubatrice. 16 ore dopo la trasfezione rimuovere media IMDM e sostituirlo con DMEM. 4. Lisi delle cellule e la raccolta di rAAVs (2 ore) 72 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto da piastre di coltura cellulare e scartare. Tutti i rifiuti devono essere trattati con soluzione disinfettante Virkon o altro idoneo. Lavare delicatamente le cellule in caldo 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7,4). Aggiungere 25 ml di PBS caldo a ogni piatto e rimuovere delicatamente le cellule con un raschietto cellula. Raccogliere sospensione in provette da 50 ml. Cellule pellet a 800 xg per 10 minuti. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8.0, utilizzare 10 ml per piastra di coltura tissutale. Diviso in due provette da 50 ml. Preparare una soluzione fresca di deossicolato di sodio al 10% in DH 2 O. Aggiungere 1,25 ml di questo per ogni provetta per una concentrazione finale di 0,5%. Aggiungi benzonasi nucleasi ad una concentrazione finale di 50 unità per ml. Mescolare accuratamente tubo. <li> Incubare a 37 ° C per 1 ora. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 3000 xg per 15 minuti. Trasferimento a fresco tubo da 50 ml, garantisce tutti i detriti delle cellule è stata rimossa per evitare il blocco delle colonne eparina (vedi punto 5). In questa fase, i campioni possono essere conservati a -20 ° C prima di continuare. Abbiamo conservato i campioni per diverse settimane a -20 ° C senza una riduzione della infettività. 5. Colonna di purificazione eparina rAAVs (2 – 3 ore) Setup HITRAP colonne eparina utilizzando una pompa peristaltica in modo che le soluzioni di flusso attraverso la colonna a 1 ml per minuto per i passi 5,2-5,4. E 'importante garantire l'assenza di bolle d'aria sono introdotti nella colonna eparina. Equilibrare la colonna con 10 ml di 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Applicare 50 ml di soluzione di virus alla colonna e lasciar fluire. Lavare la colonna con 20 ml di 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Usando una siringa da 5 ml di continuare a lavare la colonna with 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0, seguito da 1 ml 300 mm NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Gettare il flow-through. Con 5 ml siringhe ed eluire una leggera pressione il virus dalla colonna mediante l'applicazione di: 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 3,0 ml 450 mm NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 Raccogliere questi in una provetta da centrifuga da 15 ml. 6. Concentrazione e filtrazione sterile di rAAVs (1 ora) Concentrato vettoriale utilizzando Amicon unità centrifughe ultra-4 filtro con un cut-off 100.000 peso molecolare. Carico di 4 ml di eluato della colonna nel concentratore e centrifugare a 2000 xg per 2 minuti (a temperatura ambiente). Eliminare eluato e concentratore ricaricare con la soluzione antivirus rimanente e centrifugazione ripetere. Il volume concentrato dovrebbe essere di circa 250 microlitri. Se il volume è molto concentrato più di questo, scartare il flusso tttraverso e continuano a centrifuga a intervalli di un minuto fino a quando il volume è di circa 250 microlitri. Aggiungere 250 microlitri di PBS al virus per un volume finale di 500 microlitri e togliere dal concentratore. Vettore filtrare da 13 mm di diametro filtro da 0,2 micron siringa. Vettore deve essere aliquotati e conservati a -80 ° C fino al momento. 7. Titolazione degli stock virale (3 giorni) Ciò richiede un promotore che è attiva in cellule HEK293 guida di un gene reporter o un prodotto del gene immunocytochemically rilevabile. Quando si produce un vettore che non è compatibile con cellule HEK293 altre linee cellulari o colture cellulari primarie possono essere utilizzati. Preparare 18 poli-L-lisina coprioggetto vetro rivestito o 18 pozzi di diapositive camera Nunc da semina HEK293 cellule in modo che siano 40 – 50% confluenti. Per la titolazione di Cre-dipendente rAAVs uso HEK293 cellule che esprimono stabilmente Cre ricombinasi 2. Infettare ogni pozzetto con serie dilutions del vettore AAV (Fig. 2A). Utilizzare 3 pozzi per diluizione. Noi abitualmente aggiungere virus direttamente a ciascun pozzetto. Dopo 72 ore riparare cellule HEK293 con l'aggiunta di un volume pari al 4% paraformaldeide (PFA) e medie (dando una concentrazione finale del 2% PFA) per dieci minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule per tre volte in PBS, sciacquare in dH 2 O e coprioggetto. Contare il numero di cellule trasdotte dai tre pozzi che hanno il più alto fattore di diluizione, ma contengono ancora cellule infettate, trovare la media di questi e moltiplicare per il fattore di diluizione per dare il numero di unità infettive per microlitro (Fig. 2B). 8. Risultati attesi HEK293 cellule trasdotte con una codifica virus sono mostrati maggiore proteina verde fluorescente (eGFP) in Figura 2B. In genere ottenere titoli coerenti di circa 6 x 10 6 particelle infettive per litro micro. Noi abitualmente utilizzano questi vettori per stereotassica injection nel cervello di roditori adulti. Questo fornisce una potente tecnica per la regione specifica espressione genica 2. Per combinare questa specificità regione con cellule di tipo selettivo l'espressione genica abbiamo iniettare ricombinasi Cre-dipendente rAAVs nelle regioni obiettivo di Cre-topi transgenici 2. Figura 2C-E mostra esempi di iniezioni stereotassico di Cre-dipendente rAAVs codifica eGFP in differenti regioni del cervello adulto di parvalbumina Cre-topi transgenici 3. Figura 1. Illustrazione schematica del protocollo per la produzione di rAAV. . 1) HEK293 cellule sono placcati e cresciuto fino a 70-80% confluenza. 2.) AAV e plasmidi helper sono preparati e trasfettati in cellule HEK293. 3.) Media viene ripristinata DMEM 16 ore dopo la trasfezione e HEK293 le cellule sono coltivate per un altro 56 ore. 4.) HEK293 cellule vengono raccolte e lisate. rAAV vettori sono separati da detriti cellulari da centrifugation. 5.) Particelle virali sono purificati attraverso colonne di eparina prima la concentrazione e la sterilizzazione. 6.) HEK293 cellule sono coltivate su ben 24 tavole ed infettare con diluizioni seriali del vettore AAV per determinare il numero di unità infettive. Figura 2. Titolazione e in applicazione in vivo di rAAV1 / 2. (A) installazione di cellule HEK293 per la misurazione titolo virale. HEK293 cellule vengono trasdotte con diluizioni seriali di rAAVs. C, il controllo non infettate, N, 1 ml di diluito magazzino virale. (B) HEK293 cellule infette con rAAVs esprimere eGFP. (CE) espressione eGFP virale è limitato a Cre-esprimere i neuroni in regioni diversi target di parvalbumina Cre-topi transgenici dopo l'iniezione stereotassica di Cre-attivi rAAVs. Immagini esempi mostrano immunoreattività GFP in (C) il pallido reticolare talamo e globus, (D) il giro dentato e (E) la regione CA1 dell'ippocampo. DG, dentate giro, RT, nucleo reticolare del talamo; GP, globo pallido. Bar Scala: B, 500 micron, C, 100 micron, D, 100 micron; E, 500 micron.