Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans</em

1. Bau einer Laser-Ablation System Tragen Sie Laserschutzbrillen und gutes Lasersicherheit Praktiken bei der ersten Ausrichtung. Niemals durch die Okulare schauen, wenn der Laser auf. Ordnen Sie die Komponenten auf dem Steckbrett wie in Abb. gezeigt. 1 (siehe auch Beispiel 2). Bolt auf der Laser (mit einer Riser-Platte bei Bedarf), Periskop Post, und der Hochbahn unterstützt. Positionieren Sie Ihr Mikroskop mit der Schiene Achse auszurichten. Richten Sie mit dem übertragenen Lichtstrahl aus dem Mikroskop Kondensorlinse. Richten Sie die Schiene Höhe (mit einem Pegel) und die Position mit einer einstellbaren Blende oder eine Linse angebracht, um die Schiene. Die Blende oder Objektiv muss an beiden Enden der Schiene in den Kondensator Strahl ausgerichtet werden. Lab-Buchsen können mit dem Rail-Höhenverstellung helfen. Richten Sie den Glan-Thompson Polarisator und Halbwellenplatte zum Laserstrahl. Sie brauchen nicht den Laser auf diese Ausrichtung zu tun. Die beam muss nur durch die beiden, ohne auf den Kanten gehen. Drehen Sie den Polarisator um eine bequeme Position und Orientierung für den Beam Dump (Abb. 1) liefern. Sie drehen die Halbwelle Platte Laserleistung. Befestigen Sie die Komponenten mit dem Steckbrett. Schalten Sie den Laser, setzen Sie die Pulsfrequenz bis 100, kontinuierlichen Betrieb und die Leistung reduzieren auf ein Minimum mit dem Halbwellenplatte. Verwenden Sie ein Post-it-Zettel oder Brillenputztuch, um den Laserstrahl zu visualisieren. Einstellen und fixieren die kinematisch montierte Spiegel in Folge aus dem Laser, um den Strahl zu bringen, um den Spiegel, die auf das Ende der erhöhten Schiene montiert ist. Der Laserstrahl sollte in etwa der Mitte der Spiegel ausgerichtet werden. Die Spiegel sollten etwa 45 Grad, um den Laserstrahl-Achse (Abb. 1) orientiert werden. Grob Einstellung der kinematisch montierten Spiegel auf der Oberseite des Periskop und am Ende der Bahn, um den Laserstrahl in die Mitte der übertragenen Lichtstrahl aus dem Mikroskop ausrichten. Sowohl der Laserstrahl und ter übermittelt Lichtstrahl aus dem Mikroskop können gleichzeitig visualisiert Einlegen von Papier in den Strahlengang. Achten Sie darauf, keine ND-Filter und Öffnungen in der Zwischen-Modul werden oder vollständig zu öffnen. Fein align des Laserstrahls auf das Zentrum der Sendelichtstrahl mit den Feineinstellungen an der Oberseite Periskop und Schiene Spiegel. Halten Sie das Papier in der Nähe der Schienen-Spiegel und richten Sie den Laserstrahl auf die Mitte des Sendelichtstrahl mit den Top-Periskop Spiegel. Halten Sie das Papier in der Nähe des Mikroskops Anschluss und richten Sie den Laserstrahl auf die Mitte des Sendelichtstrahl mit der Schiene die Korrektur der Spiegel (Abb.2). Position eines Post-it-Zettel in den Strahlengang zwischen den ausgerichteten Kondensorlinse und das offene Objektivrevolver. Sie sollten die übertragenen Lichtstrahl mit dem kleineren Laserstrahl in der Mitte zu sehen. Verwenden Sie die Feineinstellungen an der Schiene Spiegel zum Zentrum des Laserstrahls. Fix dem Mikroskop statt mit Klemmen. Die Schritte 10,9-1,12 sind optional, aber es ist einfach und nützlich, um die Ausrichtung und Laserablation, bevor Sie den Strahl expandiert Linsen zu beurteilen. Schalten Sie den Laser und greifen die mechanische Sicherheit Verschlusszeit. Drehen Sie den 50% dichroitische aus dem Strahlengang. Auch wenn keine direkte Laserlicht auf die Okulare passieren wird, kann das reflektierte Licht sehr intensiv. Montieren Sie die Ziel-Rutsche für die Fein-Ausrichtung und Bild mit dem 60X Öl-Objektiv. Konzentrieren Sie sich auf Kratzer auf der Folie. Geben Sie hier die ND4 und ND8 Filter in Zwischen-Modul. Bild der Ziel-Dia mit CLSM, Spinning-Disk oder CCD-Kamera-System. Drehen Sie den 50% dichroitische in den Laser-Weg. Von diesem Punkt sollte man sich nie durch Okulare schauen, während der Ablation Laser auf. Schalten Sie den Abtragslaser und stellen Sie den Modus ausgelöst, Frequenz bis 100 und Pulszahl auf 10. Achten Sie darauf, die Macht noch auf das Minimum mit dem Halbwellenplatte eingestellt und öffnen Sie dann die mechanische Sicherheit Verschlusszeit. Sie können simultaneously Bild und verwenden Sie die Abtragslaser. Während Bildgebung das Ziel schieben, lösen die Abtragslaser. Überprüfen Sie die Ziel-Rutsche für eine Ablation Ort 1-10 um im Durchmesser. Sequenziell entfernen ND-Filter bis zu einer Ablation Spot zu sehen ist. Passen Sie die Ablation Ort, um die Mitte des Bildes mit der Schiene Spiegel. Sie hinzufügen möchten wieder ein ND-Filter, um Platz zu fein zu erhöhen Laserleistung mit dem Halbwellenplatte eine <1 um Ablation vor Ort geben. Bild bei 0,2 um / Pixel oder weniger und Feineinstellung der Ablation Ort, um die Bildmitte (Position 256.256 mit 512×512 Bild). Überprüfen Sie die Tiefenschärfe und die Achse des Laserstrahls. Fokus auf und ab 1-2 um und überprüfen Sie die Ablation Position und Ablation Spotgröße. Wenn der Laserstrahl axial ausgerichtet ist die Ablation vor Ort wird sich nicht bewegen. Die unbedingte Laserstrahl wird Macht über mehrere um zu verteilen (ca. 3-5 um von oben nach unten unscharf). 2. Add-Objektive, um den Laserstrahl zu erweitern, um das Ziel wieder füllenBlende und stellen die Konvergenz zu konzentrieren Kontrolle Dieses System verwendet zwei galiläischen Beam Expander, um den Laserstrahl zu erweitern, um den Rücken Apertur des Objektivs (10 mm) füllen. Montieren Sie die 4 Linsen auf Träger und sie an die Schiene (L1f1 + L2f2 und L3f1 '+ L4f2'). Stellen Sie die Positionen, so dass alle Objektive an der gleichen optischen Achse sind, und genau orthogonal zum Laserstrahl (Abb. 2). Schalten Sie den Laser und passen sie an minimalen Strom-und Dauerbetrieb. Grob einstellen Strahlausrichtung durch jedes Objektiv mit Papier, um den Laserstrahl sehen und übertragen Lichtstrahl von Mikroskopkondensor. Schalten und Verschlusszeit des Lasers. Entfernen Sie die Klammern von einer Seite des Mikroskops und schieben Sie das Mikroskop aus der Laser-Strahlengang. Schalten Sie den Laser und entfernen Sie die Sicherheit Verschlusszeit. Die Fein-Ausrichtung der Linsen und der Laserstrahl kann durch Anzeigen der erweiterten Laserstrahls auf einer nahe gelegenen Wand durchgeführt werden. Der Strahl sollte sich ausdehnen und zusammenziehen symmetrisch, wenn die leNSEs verschoben werden. Passen Sie die letzten zwei kinematisch montierte Spiegel, um den Strahl (Abb. 3) ausrichten. Der ausgerichtet und erweitert Strahlprofil sollte kreisförmig sein und von gleichmäßiger Helligkeit (Abb. 3). Die Größe und Gleichmäßigkeit der Strahl mit einem eingesehen werden Post-it-Zettel in der geschätzten Position des Objektivs zurück Blende. Der Strahl sollte auf Null Konvergenz für die Unendlichkeit optische Systeme angepasst werden. Konvergenz kann mit der Feststellung, wie der Strahl Größe geschätzt werden, wie Sie ein Post-It zu bewegen beachten Sie weiter von Linsen. Schalten Sie den Laser und greifen die mechanischen Verschluss. Schieben Sie das Mikroskop zurück in den Laser-Strahlengang mit dem festen Klemmen, um die richtige Ausrichtung zu definieren. Ersetzen Sie die Klemmen auf der freien Seite des Mikroskops, aber nicht festziehen. Schalten Sie den Laser und entfernen Sie die Sicherheit Verschlusszeit. Drehen Sie den Objektivrevolver in eine offene Position. Legen Sie eine Post-it-Zettel auf der Bühne. Sie sollten das erweiterte und einheitliche Laserstrahls auf dem Durchlicht b zentrierteam aus dem Kondensator (Abb. 4). Sie können ihn zu zentrieren, indem Sie die Mikroskop-Klemmen und sorgfältig nudging dem Mikroskop notwendig. Schalten Sie den Sicherheits-Verschluss, und stellen Sie den Laser-Modus auslösen. Drehen Sie den 60X Ziel in Ort und Bild der Oberfläche Kratzer auf dem Ziel gleiten. Entfernen Sie den Sicherheits-Verschluss, lösen die Abtragslaser und passen Sie die Laserleistung für die minimale Abtragung vor Ort. Die Ablation Stelle sollte rund sein und innerhalb von 5-10 um der Bildmitte. Zentrum der Ablation Spot mit Feineinstellung der kinematisch Schienenflurbahnen Spiegel. Sie müssen iterativ anpassen der Schiene montiert und top Periskop Spiegel, beide Mitte der Ablation Ort und Aufrechterhaltung eines einheitlichen Strahlprofil. Bewerten Sie die Z Fokus des Lasers durch das Verschieben des Fokus systematisch nach oben und unten in 1 um Schritte und die Auslösung der Abtragslaser. Die erweiterte, ausgerichtet und Konvergenz eingestellt Strahl sollte maximal Ablation auf das Bild konzentrieren und schwach oder gar nicht 1 um above oder unterhalb Fokus (Abb. 5). Stellen Sie die Z Fokus der aufgeweitete Strahl durch Verschieben der Linse L3 des Galilei-Fernrohr (Abb.2). 3. Laser Axotomie und Zeitraffer-Mikroskopie Axonregeneration Mikrowelle 10% Agarose (RPI Molecular Biology Grade EBO 0,1 A20090) in ausgewogener Salzlösung bis vollständig geschmolzen. Set auf einer heißen Platte zu halten, schmolz während des Einsatzes für die Montage. Ein Tropfen geschmolzenen Agarose wird auf eine Glasplatte gelegt und abgeflacht mit einem anderen Objektträger in ein Pad ungefähr 200 um dick (eine einzelne Schicht aus der Zeit Band auf benachbarten Folien als Abstandshalter verwendet wird). A "Sharpie" Marker-Kappe dient zum Ausschneiden eines uniformierten Durchmesser runden Pads von 13mm. Betäubungsmittel (1UL Muscimol 20mm) und Microspheres (Chris Fang-Yen, persönliche Mitteilung) (1UL 2,65% Polystyrol 0,1 um in Wasser) in die Mitte des Pads um 3-5 Würmer orientierten zugegeben, gefolgt, so dass sie auf ihrer linken Seite liegenden . Ein Deckglas aufgebracht wird und anschließend Vaseline wird verwendet, um das Deckglas versiegeln und verhindern Verdampfung der Probe (Abb. 6). Die Abtragslaser ist Fadenkreuz ausgerichtet ist, wie oben beschrieben, zu Beginn jeder Sitzung. Schalten Sie den Laser-Sicherheit Verschlusszeit. Entfernen Sie den Laser-Ausrichtung Ziel und Bild eine Montage erwachsenen Wurm mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff in der Ziel-Neuronen. Bild Axone in einer ähnlichen Vergrößerung (0,2 um / Pixel oder höher Vergrößerung) und die Position unter dem Fadenkreuz (Abb. 7). Öffnen Sie die Lasersicherheit Verschlusszeit und lösen die Abtragslaser während Bildgebung. Bewerten Sie die Axon nach Auslösung des Lasers und langsam erhöhen, Laserleistung, bis das Axon geschnitten wird. Sie werden über 10x mehr Laserleistung müssen Axone als geschnitten, um eine Ablation Fleck auf der Ausrichtung Ziel schieben (ca. 1uJ / ns Puls) zu bilden. Wir in der Regel mit 100 Impulsen bei 2,5 kHz und Macht auf ungefähr 0.27mW (durchschnittliche Leistung bei Probe mit Coherent FieldMaxII Leistungsmesser und Laser-Set zur kontinuierlichen bei 2500 Hz gemessen) geschnitten. Die AblationLaserleistung Einstellung übereinstimmen werden zum Schneiden von Axonen in zukünftigen Experimenten (Abb. 7). Ein erfolgreich abgeschnitten Axon wird eine Pause von etwa 0,5-1 um, ohne einen Verlust an Helligkeit in den beiden abgeschnittenen Enden (Abb. 7) zeigen. Ein großer Verlust von Helligkeit oder eine große Lücke (2-10 um) oft bedeutet erhebliche Schäden über das Axon von einer Kavitationsblase. Die proximalen und distalen Axonen wird getrennt und bilden Rückzug Glühbirnen in den nächsten 30 Minuten (Abb. 8 und Movie). Äquilibrieren Ihren montiert Würmer mit Ihrem Mikroskop Bühne für 30 Minuten, bevor Sie Ihren Zeitraffer Aufnahme. Dies minimiert Drift aufgrund von Temperaturunterschieden und Agarose Kontraktion. ) Time-Lapse-Imaging-Parameter werden mit der Imaging-Software mit Ihrem System zugeordnet ist. Wir typischerweise Bild 10-20 Z Schritte (1um/step) bei 0,1-0,2 um / Pixel mit Verstärkung, Lochkamera, Abtastrate und Imaging-Laser-Energie-Einstellungen, dass die Exposition zu minimieren und gleichzeitig geben die gewünschte räumliche Auflösung. Abtastintervalle sind typischely 1-5 Minuten mehr als 15 Stunden je nach der gewünschten zeitlichen Auflösung (Abb. 8 und Movie). Zeitraffer-Bilddaten werden in Filmen mit NIS Elements oder ImageJ umgewandelt. 4. Repräsentative Ergebnisse: Laser Axotomie mit diesem System ist eine zuverlässige und Routine. Die Ergebnisse in Abbildung 7 dargestellt sind typisch. Zeitraffer-Imaging von Axonregeneration ist sehr robust dieses Protokoll verwenden. Wir routinemäßig geschnitten und Bild bis zu 5 Axone in 5 verschiedenen Würmer auf eine einzelne Folie mit einem motorisierten Bühne. Die einzige Einschränkung ist die Zeit es braucht, um die Bilder der einzelnen Axon, z. B. sammeln, wenn es 20 Sekunden dauert, um einen Stapel für ein Axon sammeln dann höchstens Sie können 9 Axone (9 Stacks) Probe, wenn Sie Probenahme alle 180 Sekunden. Das Beispiel in Abb. 8 und 9 gezeigt, ist ein gutes repräsentatives Ergebnis. Etwa 10% der Experimente geben Ergebnisse dieser Qualität. Die restlichen Versuche liefern gute Daten über die Regeneration Phänotyp, sind aber ästhetisch unappealIng. wegen ihres geringen Jitter Bewegungen der Wurm, der sich in der Regel nach 5-8 Stunden der Immobilisierung beginnen. Abbildung 1 Laser Ablation System. Die 532 nm Nd: Yag-Laser befindet sich auf einem Riser montiert, um es auf die Höhe der anderen Komponenten zu bringen und verschraubt mit dem Steckbrett. (Optical Isolator ist optional und wahrscheinlich nicht erforderlich). Das Glan-Thompson Polarisator und Halbwellenplatte werden verwendet, um fein Kontrolle der Laserleistung. Sie sind in fein kalibrierten Rotation Reittiere. Achten Sie darauf, Einstellung der Beam Dump. Die Ecke Spiegel lenkt den Laserstrahl an der unteren Periskop Spiegel. Die obere Periskop Spiegel lenkt den Strahl auf die Schiene zu spiegeln. Die Schiene wird auf zwei Stab unterstützten Plattformen montiert. Dual-Galilei-Objektive sind zur Laufschiene montiert angebracht. Beachten Sie den zusätzlichen Zwischen-Modul, welches die Abtragslaser. Das System könnte kompakter gemacht, indem die optische isola werdentor und der Umlenkspiegel und Neupositionierung des Lasers, Glan-Thompson Polarisator und Halbwellenplatte an der hinteren Kante der Steckbrett. Abbildung 2 Dual galiläischen Conditioning Linsen werden verwendet, um die 300 um TEMoo Laserstrahl auf einen Null-Konvergenz gleichmäßig 10 mm Größe zu erweitern. Ein Labor-Buchse ist unter einer der Plattformen Halten der Schiene positioniert. Dies hilft bei der Anpassung der Schiene Höhe bei der Ausrichtung Schritte. Grob Einstellung der Schiene Höhe durch die Montage des L1-Objektiv auf die Schiene und mit dem Kondensator Strahl als eine Hilfslinie. Passen Sie die Schiene so, dass der Kondensator Strahl richtet das Zentrum der Linse an beiden Enden der Schiene. Dadurch wird die Bahn parallel zur optischen Achse des Mikroskops ausgerichtet. Möglicherweise müssen Sie zuerst das Mikroskop, um die optische Achse der Schiene passen. Verwenden Sie Klammern, um die Position des Mikroskops befestigen (siehe Abb. 1).. Entfernen the-Objektiv-Schiene montiert werden. Richten Sie nun den Laserstrahl auf die Mitte des Kondensators Balken an beiden Enden der Schiene. Ein Papier in den Strahlengang ist ein bequemer Weg, um beide Strahlen gleichzeitig zu sehen. Verwenden Sie die Top-Periskop Spiegel den Laserstrahl in den Kondensator Strahl in der Nähe der Schienen-Spiegel auszurichten. Verwenden Sie die Schiene Spiegel den Laserstrahl in den Kondensator Strahl auszurichten am äußersten Ende der Schiene (am nächsten zum Mikroskop). Montieren Sie nun alle vier Linsen auf die Schiene, wie in der Abbildung dargestellt. Die Länge der Schiene, die Brennweite der Linsen und des Objektivs Vereinbarungen werden je nach Ihrem Mikroskop und körperliche eingerichtet. Kritische Parameter sind der Laserstrahl Durchmesser und die Größe der hinteren Öffnung des gewählten Ziels. Infinity-optische Systeme konzentrieren perfekt parallelen Laserstrahl (Null-Konvergenz). Entfernung zwischen L1 und L2 sollten Summe der Linsen werden Brennweiten f1 + f2, und der Abstand zwischen L3 und L4 sollte entsprechend f1 '+ f2' werden. Der Abstand zwischen the dual galiläischen Paaren ist nicht kritisch. Position der L3 kann fein eingestellt werden, um Strahlkonvergenz Kontrolle; <1mm Anpassungen notwendig, um den Fokus des Lasers, um das Bild scharf zu stellen sein. Achten Sie darauf, alle Linsen, Filter, Blenden, etc. aus dem Zwischenspeicher-Modul, das in den Strahlengang (oder bewusst sein, was sie tun und passen Sie Ihr System entsprechend) werden könnten, zu entfernen. Abbildung 3 Ausrichtung des Laserstrahls durch die Dual-Galilei-Linsen. Entfernen Sie das Mikroskop Klemmen von einer Seite des Mikroskops so das Mikroskop kann der Strahlengang bewegt werden, aber die restlichen Klemmen ermöglicht dem Mikroskop genau positioniert werden. Denken Sie Lasersicherheit. Achten Sie darauf, die Laserleistung auf ein Minimum mit dem Glan-Thompson-Polarisator eingestellt. Schalten Sie den Laser-und Ausblick der Laserstrahl Muster an der Wand. Hier können Sie ein Papier mit Klebeband an der Wand hilft, die Laser-Blickvor Ort. Systematisch stellen die Positionen der Linsen, um ein Gefühl für das, was sie tun, um den Strahl in Größe und Aussehen zu bekommen. Sie sollten sehen, etwas, das wie Panel sieht A, wo eine intensive vor Ort ist exzentrisch in einem Dimmer-Profil entfernt. Verwenden Sie die Hutschienen-Spiegel, um die intensive Ort, um die Mitte passen, wie in Feld B nun mit Hilfe der oben Periskop gezeigt montierten Spiegel zu einer einheitlichen peripheren Profil zu geben. Wenn alles richtig ausgerichtet ist, sollten Sie jetzt feststellen, dass Bewegung der Linsen bewirkt, dass der Strahl ausdehnen und zusammenziehen symmetrisch. Bewegen Sie die Kontaktlinsen wieder auf die Ausgangsposition wie in Abbildung 2 dargestellt. Jetzt fangen die Balken in der Entfernung des Ziels zurück Blende. Es sollte rund sein, zumindest groß genug, um Ihren Rücken Öffnung zu füllen, und der eine gleichmäßige Helligkeit. Es ist OK, wenn es größer ist, solange man genügend Laserleistung für Ihre Ablationen haben. Bewerten Konvergenz durch Vergleich Strahldurchmesser in der Entfernung des Ziels zurück Blende und der Wand. Strahldurchmesser sollteidentisch sein für eine Null-Konvergenz Strahl. Maßstabsbalken ist 10mm. Abbildung 4 Ausrichtung der aufgeweitete Laserstrahl in den Kondensator Strahl. Shutter des Lasers und bewegen das Mikroskop wieder in den Weg des Laserstrahls mit dem Schellen als Ausrichtung aufhört. Schalten Sie, ausrichten und konzentrieren den Kondensator Strahl mit Hilfe eines Objektivs. Klebeband Papier über die Okulare für jeden aus der Betrachtung der intensiven reflektierte Laserlicht zu verhindern. Drehen Sie den Objektivrevolver in eine offene Position. Legen Sie ein Blatt Papier auf die Bühne, um den Kondensator Strahl verschließen. Schalten Sie den Laser zur kontinuierlichen Modus und entfernen Sie die mechanische Sicherheit Verschlusszeit. Sie sollten einige kommende Laserlicht wenn das Mikroskop. Lösen Sie das Mikroskop Klemmen und sanft anstoßen dem Mikroskop, um den Laserstrahl mit dem Kondensator Strahl auszurichten. Der Laserstrahl sollte rund sein und von gleichmäßiger Helligkeit. Es ist manchmal nützlich, ADJUst die Linsen-Schiene montiert werden. Sie sollten sich auszudehnen und zusammenzuziehen den Laserstrahl gleichmäßig, wenn die Ausrichtung korrekt ist. Sie können Zentrum der vertraglich Laserstrahl auf ein Minimum zentriert Kondensator Strahls mit dem Schienen-Spiegel und erweitern Sie dann es auf die gewünschte Größe. Nachdem Sie die Position der vertraglich Strahl einstellen mit der Schiene Spiegel, müssen Sie die oben angebrachten Periskop Spiegel nachjustieren, um eine gleichmäßige Helligkeit der aufgeweitete Strahl zu halten. Wenn Sie nicht bekommen kann eine kreisförmige zentriert Laserstrahl dann müssen Sie gehen zurück durch die frühere Ausrichtung Schritte. Abbildung 5 Center der Ablation vor Ort und stellen Sie den Laserstrahl Konvergenz für optimale Schärfe. Schalten und Verschlusszeit des Lasers. Entfernen Sie das Papier und hängen Sie die gespiegelten Ziel schieben (Sie können auch Permanent-Marker Tinte auf einem Deckglas als Ziel 2). Bild Kratzer auf der verspiegelten Oberfläche mit der 60X 1.4na Öl-Objektiv) Jetzt Bild der Oberfläche mit einem konfokalen oder CCD. Nicht durch die Okulare schauen, während der Laser eingeschaltet ist. Einschalten und unshutter des Lasers. Stellen Sie den Laser-Modus, niedrigste Leistungsaufnahme und 100 Hz ausgelöst. Auslöser etwa 10 Impulse. Sie sollten eine Ablation Stelle von 1-5 um Durchmesser in 10 um von der Mitte zu sehen. Wenn Sie nicht sehen, eine Ablation vor Ort können Sie erhöhen die Laserleistung in 5-10%-Schritten. Sobald Sie erkennen eine Ablation Spot-und mittenbetonte es das Sichtfeld. Setzen Sie das Fadenkreuz bei 256, 256 Koordinaten, wenn Anzeige 512×512 Bild. Wenn Sie den Laserpunkt anpassen, um das Zentrum dann wird es nicht ändern Position beim Zoomen. Verwenden Sie die Schiene montiert Spiegel, um die Ablation Ort, um das Zentrum Fadenkreuz bewegen. Neubewertung der Gleichmäßigkeit des Laserstrahls, indem man die Balken mit dem Ziel entfernt, wie oben in Abbildung 4 beschrieben. Stellen Sie den Strahl Einheitlichkeit mit den Top-Periskop montiert Spiegel. Wiederholen Sie die Auswertung der Ablation Kassaposition. Dies ist ein iterativer prozess, dass wiederholt, bis die Ablation Ort zentriert ist und die aufgeweitete Strahl ist einheitlich sein sollte. Wenn es richtig gemacht die Ablation Spot wird kreisförmig sein, wie in der Ablation Ort auf der Focus in der Abbildung zu sehen. Nächste Bewertung der Fokus des Laserstrahls in der Z-Achse. Auslöser der Laser Ablation Spot von etwa 1 um in der Mitte zu produzieren. Bewegen Sie nun die Folie etwa 5 um seitlich und Schwerpunkt 1 um unter der Oberfläche des Targets gleiten. Auslöser der Laser mit dem gleichen Laser-Einstellungen, wie Sie für die erste Ablation vor Ort eingesetzt. Wiederholen Sie nach dem Fokussieren 1 um über die Oberfläche des Targets gleiten. Wenn der Laserstrahl auf das Bild konzentrieren fokussiert ist, dann sollten Sie ein Muster ähnlich dem in dieser Figur gezeigt. Die größte Ablation Spot sollte, um das Bild zu konzentrieren und die Ablation Flecken ober-und unterhalb Fokus immer kleiner symmetrisch entsprechen soll. Passen Linse L3 zu Fokusebenen auszurichten. Verschieben der Linse L3 weg von dem Mikroskop wird der Strahl mehr konvergente und die Ablation Spot wird näher zu bewegendas Ziel. Kleine <1mm Anpassungen werden in der Nähe konzentrieren benötigt werden. Sie sind nun bereit, um Axone geschnitten. Maßstabsbalken ist 1 um. Abbildung 6 Montage Würmer für Laser Axotomie und Zeitraffer-Bildgebung. Agarose 10% in Kochsalzlösung bis vollständig geschmolzen erwärmt. Ein kleiner Tropfen auf ein Glas Objektträger gebracht und dann mit einer anderen Folie abgeflacht, um eine ebene Unterlage bilden. Die Dicke des Kissens wird durch Klebeband auf zwei benachbarte Schlitten gesetzt. Das Pad lässt man ca. 1 Minute eingestellt und dann die Folien voneinander getrennt sind. A "Sharpie" top wird als Ausstecher verwendet werden, um eine einheitliche Größe von ca. 13mm Pad bilden. 1 ul 10mM Muscimol und 1 ul der Mikrosphären in die Mitte des Pads (Fang-Yen persönliche Mitteilung) aufgenommen. Würmer sind die 2 ul Tropfen und orientiert, bevor auf dem Deckglas aufgenommen. Vaseline wird dann aus einer Spritze (20-25 ga. Nadel) an den Rand des Deckglases, um es abzudichten angewendet. <pclass = "jove_content"> Abbildung 7 Typische Ergebnisse der Laser-Axotomie in C. elegans. In A können die intakte Axone in Kürze sehen vor und nach der Laser-Axotomie. Die Lücke ist in der Regel etwa 0,5-1um. B zeigt Laser Axotomie von einem Axon ohne Beschädigung einer nahe gelegenen Axon etwa 1 um weg. Laser wurde auf etwa 10% Leistung (0,3 mW Durchschnitt bei 2500 Hz) und 100 Impulse gesetzt. Maßstabsbalken 5 um. Abbildung 8. Typische Wildtyp L4 Regeneration. Dies ist eine Zeitreihe zeigt Ablation und Zeitraffer-Aufnahmen von Axonregeneration. Kurz nach Laser Axotomie bei 0 Minuten sehen Sie das Einfahren Glühbirne. Mit 138 Minuten Einfahren Lampe hat wieder auf seine größte Ausdehnung gezogen und jetzt zu renovieren begonnen. Sporadische Membran Vorsprünge (mircospikes oder Filopodien) können entlang des Axons Welle (Pfeile 138 und 324) zu sehen. DieRecht Stumpf erstreckt sich eine wohlgeformte kompakten Wuchs Kegel bei 360 Minuten. Bei 414 Minuten beide Stümpfe haben das Wachstum Kegel verlängert. Die ersten embryonalen-like growth Kegel geworden dystrophischen wie sie erstrecken sich in Richtung der dorsalen Nervenstrang (414, 519 und 597 Minuten). Die dystrophischen Wachstum Kegel Stall hinter dem dorsalen Nervenstrang (960 Minuten). Pfeilspitzen weisen darauf hin, proximalen Stumpf und Wachstum Kegel. Arrows darauf hin Membran Vorsprüngen entlang der proximalen Axon Welle. Maßstabsbalken 20um. Movie 1. Movie von Wildtyp Axonregeneration. Dieser Film geht mit der Zeit Punkte in Abbildung 8 dargestellt. Worms wurden montiert, wie im Protokoll beschrieben und Axone wurden alle drei Minuten für etwa 10 Stunden abgebildet. Z-Stapel (20 X 1um) wurden zu jedem Zeitpunkt übernommen und fusionierte in einzelne Bilder von einer maximalen Ausladung Algorithmus (NIS Elements). Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.