수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석
Summary
explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.
Abstract
신경 크레스트 세포는 (NCCs) 상피 – 중간 엽 전이 1,2를 진행 한 후 등쪽의 신경 튜브 (NT)에서 이민을하는 척추 동물의 개발에 존재하는 세포의 과도 인구입니다. 자신의 목표에 도달 할 때까지 EMT 따라 NCCs는 stereotypic 경로를 따라 큰 거리를 마이그레이션. NCCs는 뉴런, glia, melanocytes, 그리고 1-3 chromaffin 세포를 포함한 세포 유형의 광대 한 배열로 차별화. 자신의 적절한 타겟 위치에 도달하고 인식 NCCs의 능력 트렁크 구성 요소를 세 NCC-파생를 포함하는 모든 구조의 적절한 형성을위한 기초입니다. 트렁크 NCC 마이그레이션에 대한 지침의 메커니즘을 Elucidating하는 것은 큰 의미를 갖는 일이었다. 많은 분자 NCC 마이그레이션 4 안내하는 입증되었습니다. 예를 들어, 트렁크 NCCs는 이러한 Semaphorin, Ephrin, 그리고 슬릿 리간드 5-8 등의 제외지도 단서에 의해 거부 될 것으로 알려져 있습니다. 그러나,하지최근 트렁크 NCCs 9 식별 된 모든 chemoattractants이 때까지.
자기편 세포의 chemotactic 동작을 공부에 체외 접근 방법에서 기존는 불후의, homogenously 배포 세포를 가지고 가장 적합한하지만, 처음 균일 분포를 부족 빠르게 (예 : NCCs 등) 차별화 특정 기본 줄기 세포 문화에 적용 할 더 도전합니다. chemotaxis 연구 트렁크 NCCs의 분포를 균질화하는 한 접근 방식이 기본 NT의 explant 문화에서 트렁크 NCCs를 분리하는 것입니다 다음, 리프트하고는 거의 100 % 합류 할 replate. 그러나,이 도금 방식은 시간과 충분한 세포를 explant 노력의 상당한 양을 필요로 거칠고이며, 생체 조건에서 발견 할 수있는 이종 방식으로 트렁크 NCCs를 배포합니다.
여기, 우리는 requirin없이 트렁크 NCCs의 chemotaxis 및 다른 철새 반응을 평가 할 수 있습니다에서 체외 접근 방식을보고균일 한 세포 분포를 GA. 이 기술은, 기본의 시간 경과 영상을 이용하여 수정 Zigmond 챔버 (표준 Zigmond 챔버가 다른 10 설명) 내부 트렁크 NCCs을 교란되지 않은. 자신의 예측 자연 방향에 수직 인 chemotactant 그라디언트로 문화의 주변에서 트렁크 NCCs를 노출하여 적용 chemotactant 기울기에 의해 유도 철새 극성에 변경이 감지 할 수 있습니다. 이 기술은 저렴 복제 치료를 당 두 개의 NT의 explants의 배양을 필요로, 거친 셀 리프팅 (예 : trypsinization 등) 방지 생체 조건에 유사한 배포판에 트렁크 NCCs을 떠난, explantation과 실험 사이의 시간의 양 다운 컷 (이 가능성이 차별화의 위험을 감소), 그리고 수많은 철새 특성을 시간 경과 평가를 할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
트렁크 NCCs에 chemotaxis 조사를 실시하는 것은 이유 시리즈 도전 입증되었습니다. 따라서 트렁크 NCCs은 트렁크 수준 NT의 주 explantation에서 구할 수해야하며 간선 NCCs는 교양 장기 경우 차별화 이기종 줄기 세포 인구를 구성합니다. 체외에서 homogenously 배포 세포 인구의 chemotactic 응답을 공부하는 종래의 방법은 먼저 세포가 고립과 chemotaxis 챔버 (예를 들어, Boyden 챔버 12)의 replated homogenou…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 방법의 개발 기간 동안 기술 지원 리노 김, 스티브 구즈만과 Ujit Satyarthi에 특별한 감사를드립니다. 마이런 호손, 리차드 Spengel, 그리고 로베르토 로자 스 여기에 사용 된 방을 가공하고 꼭 필요한 기술 지원을 제공했습니다. 특히, 로베르토 로자 스는 그림 4를 만들었습니다. 우리는 또한 위의 chemotaxis 분석의 발전에 이전 스콧 프레이저 귀중한 조언 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 NIH-MBRS 평가 점수 – 5S06GM048680-13 MEdB에 의해 CW의 CSU, 왕국 대학원 논문 지원 프로그램에서 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
Riferimenti
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Baker, C. V. . Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).
- Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
- Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
- Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).
- De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).
