T-laberinto alternancia forzada y la izquierda-derecha para la evaluación de las tareas de discriminación y de trabajo de la memoria de referencia en ratones

1. Aparatos ajuste La transmisión automática modificada por T-laberinto aparato (O'Hara & Co., Tokio, Japón) se construye de pistas blancas de plástico con 25 cm de altos muros 1. El laberinto está dividido en 6 áreas de (A1, A2, S1, S2, P1, P2) por puertas correderas (S1, S2, S3, a1, a2, p1, p2) (Figura 1) que puede abrirse automáticamente a la baja. El vástago de la T se compone de área S2 (13 x 24 cm) y los brazos de los T comprenden zonas A1 y A2 (11,5 x 20,5 cm). P1 y P2 áreas comprenden los pasajes de conexión desde el brazo (área A1 o A2) al compartimiento de partida (área S1). El extremo de cada brazo está equipada con un dispensador de pellets que automáticamente proporciona una pastilla de sacarosa (20 mg, Fórmula 5 TUT, TestDiet, Richmond, IN, EE.UU.) como recompensa. La ingesta de pellets por el ratón es detectado por el sensor de infrarrojos y se registra automáticamente por un ordenador. El dispositivo de carga acoplada (CCD) se monta encima del aparato para controlar el ratón y #x2019, el comportamiento de s, y las imágenes del aparato y el ratón son capturados por el equipo. Coloque el aparato T-laberinto en una sala insonorizada (170 x 210 x 200 cm, O'Hara & Co., Tokio, Japón) como sea posible. El aparato está iluminado por las luces fluorescentes a 100 lux en nuestro laboratorio. La intensidad de la luz podría ser más débil que el nivel de lux, pero deben mantenerse a un nivel constante durante todos los experimentos. 2. Animal preparación Casa de dos a cuatro ratones por jaula en una habitación con temperatura controlada (23 ± 2 ° C) con 12 horas de luz / oscuridad ciclo (luces encendidas a las 7:00 AM), de acuerdo a la orientación y los protocolos establecidos por el Cuidado de Animales local, y el empleo Comisión. Transferencia de todas las jaulas que contienen los ratones en la sala insonorizada de la sala de la vivienda por lo menos 30 minutos antes de la primera prueba comienza. Todos los experimentos se realizan siempre durante el mismo período de tiempo (por ejemplo, de 9:00 AM a 6:00 PM). Durante la prueba de PEríodo, los sujetos de cada genotipo o de la condición experimental deben ser probados con el fin de contrapeso, ya que podría haber un efecto potencial de las veces en un día en el desempeño de la tarea. 3. La restricción de alimentos Hasta el comienzo del experimento, dar acceso libre a la norma de pellets chow y el agua a los ratones. Desde una semana antes de las sesiones de pre-formación, pesan los ratones al día y alimentarlos con comida estándar de pellets para mantener un 80% a 85% de su peso corporal libre de la alimentación durante todo el experimento. Proporcionar a diario con ocho pastillas de sacarosa por ratón, además de estándar de pellets chow en su jaula para habituar a los pellets de sacarosa hasta el inicio de las sesiones de entrenamiento de pre-. 4. La habituación a los aparatos y la formación de pre- S Placeix bolitas de sacarosa por ratón en el centro de cada uno de los seis compartimentos del aparato, y un depósito de pellets en cada bandeja de los dispensadores de alimentos. Coloque todos los ratones en una jaula dentro del aparato y les permiten explorar libremente el aparato con todas las puertas abiertas durante 30 minutos. De un día después de la habituación, los ratones a diario sometidos a pre-entrenamiento. Con todas las puertas cerradas y el sedimento depositado en la bandeja de alimentación, ratón lugar en el área A1. Si el ratón consume el transcurrir de pellets o 5 min, transferir el ratón para el área A2 y empezar otra vez de pre-entrenamiento. Dicha formación se repite cinco veces al día, y continuó hasta que los ratones consumen más de 80% de los pellets. Después de las sesiones de entrenamiento son pre-completa, los ratones son sometidos a cualquiera de una tarea de alternancia forzada o izquierda-derecha tarea de discriminación. 5. La alternancia forzada tarea En la tarea de alternancia forzada, cada ensayo consta de un fol elección de ejecución forzadaseguido por un plazo de libre elección. Ejecute el programa de aplicación (imagen TM) para el inicio de la tarea, y coloque el ratón en el cajón de salida (área S1). Haga clic en el botón de inicio, y comienza una carrera de elección forzada. En esta ejecución, las puertas de caja de inicio (puerta S2) y de área A1 o bien (puerta A1) o zona A2 (A2 puerta) se abren, y una sacarosa sedimento se envían automáticamente a la bandeja de alimentación de la zona con la puerta abierta . El ratón se le permite entrar en el área y para consumir la pastilla. Cuando el ratón se ha comido la pastilla, la puerta cerca de la bandeja de comida del brazo que el ratón se queda en la actualidad (ya sea p1 puerta o P2) se abre. Luego, el ratón se acerca a la puerta (S1 o S3) vecinos de la casilla de inicio, y ya sea la puerta de p1 o p2 está cerrada y los s1 puerta (o S3) se abre para que el ratón se puede volver al cuadro de inicio. Si el ratón no come la pastilla en 30 segundos, la respuesta se registra como un "error de omisión". A continuación, el precipitado se elimina automáticamente de la bandeja de alimentos y tél la puerta del brazo que los ratones alojado (ya sea P1 o P2) se abre, y luego el ratón se puede volver al cuadro de inicio. Después de la carrera de elección forzada, la ejecución de libre elección se inicia automáticamente. La puerta s2 y tanto las puertas A1 y A2 se abren. El ratón se le permite elegir entre los dos brazos. Si el mouse entra en el brazo opuesto al que se vio obligado a elegir en el plazo de elección forzada, su respuesta se considera que es "correcto" y el ratón recibe una pastilla de sacarosa. Si el ratón no come la pastilla en 30 segundos, la respuesta se registra como un "error de omisión", y el sedimento se eliminan automáticamente de la bandeja de comida. Si el ratón pasa con el brazo mismo que visitó en la tarea de elección forzada, el ratón está confinado dentro de la zona durante 10 segundos como castigo ("Error" de respuesta). Entonces, las puertas de la P1 (o S1) y P2 (o S3) se abren, y el ratón se puede volver al cuadro de inicio. Un ratón es sometido a 10 ensayos consecutivos en un período de sesiones pordía (corte tiempo, 50 min). Los ratones de control son entrenados diariamente para alcanzar un promedio del grupo de 80% de respuesta correcta en una sesión. El promedio del grupo de respuesta correcta se calcula promediando las respuestas correctas% de cada ratón en una sesión en cada grupo. Después de los ratones de control y / o experimentales están capacitados para el criterio, que aún puede probar los ratones en la tarea retardada de alternancia mediante la inserción de 3 -, 10 -, 30 – o 60-S los retrasos entre la elección forzada y la libre elección- ejecuta. Después de cada sesión, vuelve a los ratones a su jaula, y limpiar el aparato con agua súper hipocloroso (pH 6-7) para evitar un sesgo basado en señales olfativas. 6. Izquierda-derecha tarea de discriminación En la tarea de discriminación de izquierda a derecha, cada ratón se le da un plazo de libre elección de los 10 o 20 ensayos. Un sacarosa sedimento se entrega siempre a la bandeja de alimentación de uno de los brazos, a saber, el brazo meta. Los ratones tienen que aprender a entrar en el grupo objetivo. La ubicación del objetivoel brazo es invariable en todos los ensayos y las sesiones, y se compensa a través de ratones control y experimentales. Ejecute el programa de aplicación (imagen TM) para el inicio de la tarea, y coloque el ratón en la caja de inicio (área S1). Haga clic en el botón de inicio, y comienza una carrera de libre elección. En este plazo, la puerta de s2 y las dos puertas A1 y A2 se abrió, y un dispensador de pellets ofrece automáticamente una pastilla a la bandeja de comida del brazo de meta. El ratón se le permite elegir libremente entre los brazos izquierdo y derecho. Cuando el ratón entra en el grupo meta, se considera una respuesta correcta. Si el ratón se come el pellet o 30 segundos transcurren, p1 pista (o P2) se abre. Cuando el ratón se acerca al cajón de salida al pasar por el área de P1 (o P2), s1 puerta (o S3) se abre para que el ratón se puede volver al cuadro de inicio. Un ratón se somete habitualmente a 10 a 20 ensayos consecutivos en un período de sesiones por día (tiempo de corte, 50 min). Los ratones de control son entrenados diariamente para alcanzar un promedio del grupo de 80% correct respuesta en un período de sesiones. El promedio del grupo de respuesta correcta se calcula promediando las respuestas correctas% de cada ratón en una sesión en cada grupo. Después de alcanzar el criterio de los ratones, se puede dar sesiones adicionales a los ratones, ya sea para evaluar la memoria de retención y volver a aprender mediante la inserción de un retraso de varias semanas entre las sesiones o para evaluar la flexibilidad de comportamiento mediante la colocación de la recompensa en el frente, el brazo previamente trampas sin cebos (es decir, la inversión aprendizaje), según sea necesario. Después de cada sesión, vuelve a los ratones a su jaula, y limpiar el aparato con agua súper hipocloroso (pH 6-7) para evitar un sesgo basado en señales olfativas. 7. Análisis de imágenes Comportamientos en el aparato T-laberinto son registrados por una cámara de vídeo conectada a un ordenador y la imagen se almacena en un formato TIFF. La aplicación que se utiliza para obtener y analizar los datos sobre el comportamiento de la imagen (TM) se basa en la imagen pública del programa de dominio J (desarrollado porWayne Rasband en el Instituto Nacional de Salud Mental y disponible en http://rsb.info.nih.gov/ij/ ), que fue modificada por Tsuyoshi Miyakawa (disponible a través de O'Hara & Co., Tokio, Japón). El programa de la imagen TM genera automáticamente los archivos de texto para el porcentaje de respuesta correcta, la latencia (segundos) para completar una sesión, la distancia recorrida durante la sesión, y el número de errores de omisión en la sesión. Además, las imágenes de trazas de un ratón, los datos en bruto de posición, y los datos en bruto de respuesta (omisión correcta, o error) en cada carrera se producen y se guarda. 8. El análisis estadístico Analizar cada uno de los datos de comportamiento por parte de dos vías (condición experimental (por ejemplo, genotipo) sesión X o condición experimental RETRASO x) análisis de medidas repetidas de la varianza. 9. Los resultados representativos Un ejemplo de los resultados de T-laberinto α-CaMKII + / – maratones LE y sus compañeros de camada de tipo salvaje de control (C57BL/6J fondo) (11-18 semanas de edad, n = 10 por grupo de alternancia forzada o izquierda-derecha tarea de discriminación) se muestra en las figuras 2-4. Debido a α-CaMKII + / – ratones muestran altos niveles de agresión hacia sus compañeros de jaula 2,3, tanto los mutantes y los ratones de control fueron alojados individualmente en una jaula de plástico (22,7 x 32,3 x 12,7 cm) después del destete. Los experimentos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Salud de la Universidad Fujita. En la tarea de alternancia forzada, los ratones de control cada vez más aprender a tomar decisiones correctas, y por lo general puede alcanzar el criterio de una media de respuesta del 80% de respuestas correctas en alrededor de 1 a 2 semanas (Figura 2A). En comparación con los ratones de control, α-CaMKII + / – ratones mostraron un porcentaje significativamente menor de respuestas correctas (GENOTIPO: F (1,18) = 29.04, p <0,0001) y menor latencia (GENOTIPO: F (1,18) = 8,88 , p = 0,008; GENOTIPO Sesión X: F (9,162) = 2.24, p = 0,0218) y viajó por una más corta dIstance (GENOTIPO: F (1,18) = 8,67, p = 0,0086; GENOTIPO X Sesión: F (9,162) = 3.19, p = 0,0014) que los ratones de control (Figura 2A, B y C). No tiene efecto significativo del genotipo se encontró en los errores de omisión (Figura 2D). Además, en la tarea retardada de alternancia, los porcentajes de elección correcta de α-CaMKII + / – ratones fueron significativamente más bajos que los de ratones de tipo salvaje en cualquier tiempo de retardo (GENOTIPO: F (1,18) = 38.781, p <0,0001; RETRASO : F (3,54) = 8,074, p = 0,0002; GENOTIPO X RETRASO: F (3,54) = 0,223, p = 0,88; Figura 3). Estos resultados indican que los mutantes muestran deterioro del rendimiento en comparación con los ratones control, aunque los ratones mutantes podría realizar la tarea más rápido que los controles, lo que sugiere que α-CaMKII deficiencia induce un déficit de memoria de trabajo. En la tarea de discriminación de izquierda a derecha, los porcentajes de elección correcta de la α-CaMKII + / – mutantes aumenta gradualmente a través de sesiones, similar a los ratones control (Figura 4). Además, cuando un retraso de 1 mes se inserta entre las sesiones, No hubo diferencias significativas en el porcentaje de respuestas correctas entre los ratones mutantes y control. Al igual que en la tarea de alternancia forzada, α-CaMKII + / – mutantes mostraron una latencia significativamente más corto para completar un período de sesiones (GENOTIPO: F (1,18) = 12.12, p = 0,0027) y más corta la distancia recorrida en el aparato durante una sesión (genotipo : F (1,18) = 25,08, p <0,0001; GENOTIPO Sesión X: F (15,270) = 2.83, p = 0,0004) que los ratones control a través de las sesiones de entrenamiento (Figura 4B y C). Estos datos indican que no α-CaMKII dosis de la deficiencia afecta a la memoria de referencia según la evaluación de esta tarea. En las sesiones de aprendizaje reversión, sin embargo, α-CaMKII + / – mutantes mostraron un porcentaje significativamente menor de respuestas correctas (GENOTIPO: F (1,18) = 10,92, p = 0,0039; GENOTIPO X Sesión: F (5,90) = 5,54, p = 0,0002; Figura 4A) y tenían más errores de omisión (genotipo: F (1,18) = 17,12, p = 0,0006; Figura 4D) que los ratones de control. Estos hallazgos sugieren que la α-CaMKII + / – ratones mutantes han reducido la flexibilidad del comportamiento. <clase p = "jove_content"> Figura 1. (A) T-laberinto aparato para la alternancia forzada y de izquierda a derecha las tareas de discriminación. La cifra se cita a Takao et al. (2008). (B) La imagen fue capturado por una cámara CCD montada por encima del aparato. El T-laberinto está dividido en 6 áreas de (A1, A2, S1, S2, P1, P2) por puertas correderas (S1, S2, S3, a1, a2, p1, p2). (C) de configuración y la orientación de las claves de aparatos y extra-laberinto-en una sala insonorizada. Dos aparatos se colocan mirando en la misma dirección hacia una pared en una sala insonorizada, y los objetos, como una puerta de la habitación, las luces fluorescentes en el techo, las paredes de la sala, cámaras CCD de los aparatos, y los estantes para acomodar el ratón jaulas se han colocado. Figura 2. T-laberinto tarea de alternancia forzada. Los ratones recibieron 10 ensayos diarios por Session. Datos de (A) el porcentaje de respuestas correctas, (B) de latencia (segundos), (C) la distancia recorrida (cm), y (D) el número de errores de omisión representados como los medios con los errores estándar para cada bloque de dos sesiones, y se analizados por un ANOVA de dos vías de medidas repetidas. α-CaMKII + / – ratones mostraron un menor porcentaje de respuestas correctas (p <0,0001) y una latencia más corta (p = 0,008), y recorrió una distancia más corta (p = 0,0086) que los ratones control a través de sesiones. Figura 3. T-laberinto tarea de alternancia forzada con demoras de 3, 10, 30 y 60 seg. Aproximadamente 24 horas después de la última sesión de entrenamiento, los ratones fueron sometidos a cinco sesiones de retardo. El porcentaje de respuestas correctas para cada retraso se representa como los medios con los errores estándar, y se analizaron mediante un ANOVA de dos vías de medidas repetidas. α-CaMKII + / – ratones mostraron un menor porcentaje de respuestas correctas que los ratones control en cualquier demoratiempo (p <0,0001). Figura 4. T-laberinto de izquierda a derecha tarea de discriminación. Los ratones recibieron diariamente 10 ó 20 ensayos en una sesión. Datos de (A) el porcentaje de respuestas correctas, (B) de latencia (segundos), (C) la distancia recorrida (cm), y (D) el número de errores de omisión son representados como los medios con los errores estándar para cada bloque de 20 ensayos, que se analizaron mediante un ANOVA de dos vías de medidas repetidas. Durante las sesiones de formación inicial y las sesiones de reaprendizaje un mes después de la última sesión de entrenamiento, el porcentaje de respuestas correctas no difieren significativamente entre los α-CaMKII + / – mutantes y los ratones de control. Los ratones mutantes, sin embargo, mostraron un porcentaje significativamente menor de respuestas correctas que los ratones de control durante las sesiones de aprendizaje inverso (p = 0,0039).