Evaluación de la migración de las células madre del cáncer compartimentar Utilizando dispositivos de microfluidos y imágenes de células vivas

1. BTSC de disociación celular BTSCs se derivan de pre-existentes cultivos crecidos en medio libre de suero de células madre como neuroesferas. cultura de la que se ha descrito previamente 10, 11. Preparar suspensión de células de BTSC derivados de neuroesferas. BTSC derivados de neuroesferas se recogen en un tubo cónico de 15 ml y se centrifugó a 900 rpm durante 5 minutos. Más rápido centrifugación puede cortar y / o daños en las neuroesferas. El sobrenadante se aspiró y cultura neuroesfera se resuspendieron en 0,5 ml de pre-calentado Accutase. Esta solución se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C permitiendo que las neuroesferas para aflojar. Las células se rompieron con mecánicamente 10-20 golpes suaves de una pipeta P100 y luego 1,5 ml de medio de células madre se añadió a las células para neutralizar el Accutase. Los BTSCs se centrifugan a 1300 rpm durante 5 minutos, y se resuspendieron en 1 ml de medio de células madre. Una parte alícuota de 50 l se retira de las suspension y se colocó en un tubo de microcentrífuga para el recuento celular. 50 l de azul de tripano se añade al tubo de Eppendorf y la suspensión se coloca en un hemocitómetro para el recuento celular. Si es necesario después de recuento de células, medio adicional de células madre se añade a la suspensión BTSC para dar una densidad celular de 20.000 células vivas / medios mu l. 2. Fabricación de bi-capas SU-8 maestro y moldeo de sello PDMS (ver figura 1) Nuestro método de litografía óptica y litografía blanda para fabricar SU-8 maestro y sello PDMS, que son esenciales para el montaje de los dispositivos de microfluidos. Ligeramente diferente que el procedimiento estándar 12, nuestro SU-8 maestro se compone de dos capas. Los microcanales 3-m de altura están fundidas en la capa primera / inferior antes en el proceso, mientras que las cámaras de 250 micras de altura de siembra y recibir son en la segunda capa / superior. A fin de que la conexión correcta entre dos compartimientos de cultivo (microcanals y cámaras), las dos capas tienen que ser alineados con precisión en la posición. Sin embargo, el grosor y la opacidad de la capa de segundo son lo suficientemente grandes como para bloquear el alineador fiducial / óptico de acceder a las características del fondo. Aquí diseñar las máscaras con los marcadores de referencia están en posición remota. Por lo tanto, estos marcadores en la primera capa puede ser selectivamente protegido mientras que hace girar la segunda capa. Como resultado, ambas capas de características se hacen en un maestro y listo para el moldeo en bajorrelieve del sello PDMS. Diseñar y preparar dos foto-máscaras. Una máscara se compone de dos marcadores de referencia y una serie de microcanales (400 micras de largo y de ancho 10-50 micras) para la primera capa. Otra máscara consta de siembra y cámaras de recepción (2 mm de largo y 600 micras) para la segunda capa. Ambas máscaras están diseñados en Illustrator (Adobe, California), impresa con impresora láser sobre películas de transparencia (piezas metálicas delgadas, Colorado), se limpiaron con isopropanol y se secó al aire. Hacer la primera capa conSU-8 fotosensible (MicroChem, Massachusetts), según el manual de producto del proveedor. En primer lugar, spin-capa de la oblea de mango (Materiales WRS, California) con 3-micras de espesor de material fotorresistente SU-8 (5), seguido de suave-cocción. El material fotorresistente es entonces expuesto ultravioleta-y curarse con la máscara correspondiente en primer contacto, seguido de post-cocción y en desarrollo. Spin-capa de la capa de segundo con 250 m de espesor su-8 (2100). Con el fin de evitar fotorresistente gruesa de bloqueo de los marcadores de referencia de la primera capa, que cubrir estas áreas con cinta adhesiva en antes de recubrimiento por rotación de la segunda capa. La cinta se despega para revelar los marcadores para fines de alineación. UV-exponer la capa de segundo con la segunda máscara. Con los marcadores de alineación reveló, es sencillo para alinearlos a los de la segunda máscara usando alineador de máscara óptica. La segunda capa de material fotorresistente es entonces ultravioleta expuesto y curado en primer contacto, seguido de post-cocción y en desarrollo. </ Li> Lucha contra el palo de la capa del maestro resultado. Para ayudar en la eliminación de curado PDMS, el SU-8 maestro puede silanizada a través de la deposición de vapor para hacer la superficie de un revestimiento antiadherente de tipo. Simplemente colóquelo en un desecador durante al menos una hora, con varias gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) solución de silano al vacío. Moho PDMS con el maestro. Mezcla de base y endurecedor de prepolímero PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) en relación 10:1 a fondo. Colóquelo en un desecador para desgasificación al vacío hasta que no queden burbujas de aire que se ve. Verter la mezcla en la máscara y desgasificar de nuevo si nueva burbuja de aire se introduce. Curar el molde sobre una placa calefactora nivel durante 2 horas a 90 º C. Después de enfriarse a temperatura ambiente, suavemente liberar el sello de PDMS. Por lo tanto, los canales están grabados en el cultivo de PDMS y listo para el montaje de dispositivo. El maestro es reutilizable para el moldeo hasta que esté agrietado o desgastado. El revestimiento antiadherente tiene que realizarse de nuevo cuando la pegajosidad recupera. 3.Montaje de los dispositivos de microfluidos y cultivo celular (figura 2) Con el fin de células de cultivo, característica grabado con sello PDMS está unido a un cubreobjetos de vidrio para formar canales cerrados. Las entradas y salidas son creados para la carga de la cultura / media. Mientras tanto, la limpieza y otros procedimientos para el sustrato de vidrio y el sello PDMS son necesarias para garantizar la compatibilidad celular. Hacer depósitos a través del sello PDMS con golpeador biopsia agujero. Elegimos a su diámetro será de 6 mm. Estos depósitos sirven para dos propósitos. Uno es mantener nutriente extra para el crecimiento celular. El otro es para el acceso de la carga de la pipeta y la aspiración al vacío. Remojar el sello de PDMS en 70% de etanol durante 30 min y luego se enjuaga con agua desionizada durante otros 10 min. El objetivo es eliminar los posibles residuos orgánicos introducidos durante el proceso de fabricación, y sin reticular contaminación PDMS. Más intensas y exhaustivas procesos de limpieza, tales como la extracción orgánica 13 </sup> Y extracción Soxhlet 14 se utilizaron en otra parte. Sin embargo, encontramos que no es necesario en la cultura BTSC. Esterilizar el sello PDMS utilizando autoclave (121 ° C, 35 min). Este paso completa la reacción de reticulación de PDMS. A partir de este paso y hasta el paso 3,6, todos los procedimientos se toman en forma estéril. El sello de PDMS se coloca luego sobre un cubreobjetos de vidrio, la cual es previamente revestida con poli-L-lisina. 15-17 El dispositivo se recubre entonces con laminina llenando el canal con solución de laminina durante la noche a 37 ° C. La laminina es aspirado desde el dispositivo y el dispositivo se lavaron con medio de células madre. Cargar suspensión de células a partir del paso 1 en embalses y canales. 11 l de células disociadas se coloca en el depósito de siembra uno. La aspiración por vacío se utiliza para forzar las células en la cámara de la siembra, si es necesario. Un adicional de 7 l de células se colocan al lado del depósito de siembra. Nota: la densidad media celda es de 20.000 células / medios mu l. En popaer cinco minutos, la siembra y embalses que reciben se inundan con los medios de comunicación. Coloque un 0.5-1 mm pre-tratada en autoclave hoja PDMS en la parte superior. La adhesión a la superficie de forma natural se produjo entre dos piezas de PDMS hará que el cultivo de células de sellado y listo para el transporte, la incubación y de imágenes microscópicas. 4. A largo plazo time-lapse de imágenes de BTSC migración con BioStation IM (Nikon Instruments Inc., Melville, EE.UU.). La combinación de cámara, software y todo incubadora, en un cuadro, este sistema microscópico permite cultura de la imagen celda sin perturbación por día. Además, su diseño único motor mueve la lente objetivo y mantiene fase estacionaria muestra en la característica de punto de visita. Esto hace que sea práctico para experimentos de imágenes en paralelo y la locomoción celular pista de ensayo de alto rendimiento. Pre-equilibrar el IM BioStation durante 45 minutos para estabilizar el suministro de la temperatura, la humedad y el aire. Además de varios agua-contobjetivó platos en la cámara de muestra se utiliza para mantener la humedad adecuada. Cargue el dispositivo celular-contenido en la cámara de muestras del microscopio, y centrarlo con unas pinzas micro. Establecer el enfoque, la posición de puntos y los puntos temporales en software BioStation e iniciar el lapso de tiempo. 5. Los resultados representativos: Ejemplos de inspección visual y caracterización de la migración de las células cancerosas mediante el uso de un dispositivo de microfluidos en compartimientos se ilustran en la Figura 3 y la Figura 4. La línea celular es BTSC. Con nuestra configuración actual, las imágenes de fase de cultivo celular se puede registran continuamente durante el tiempo que 5 días (Figura 3) y tan frecuente como cada 2 segundos (Figura 4). Más allá de 5 días, los medios de cultivo deben ser reemplazados por la reposición de nutrientes y retirada de desechos. Nuestro largo plazo de lapso de tiempo identifica una secuencia rotatorio de seis etapas celulares durante su migración basado en los cambios morfológicos. Como se ilustratrado en la figura 3, se los describe como (i) antes de la migración, (ii) el inicio, (iii) la trayectoria de exploración, (iv) de crucero, (v) destino exloration y (vi) después de la migración. En la cámara de recepción, en forma de huso células permanecen en la etapa (i) como en los tumores a granel que son capaces de crecer, dividirse y migrar gradualmente. Cuando se acercan a la entrada del microcanal, unas pocas células proceder a la etapa (ii) cuando se expanden y generan saliente adhesivo. Sólo uno de ellos es capaz de ocupar la entrada y proceder a la etapa (iii), el cual puede explorar la dirección de migración. Una vez que la célula determina la dirección de la migración, se procede a la etapa (iv) para navegar a través del microcanal en una velocidad constante y alta, que se lleva a través de todo el microcanal. Al final del producto microcanal, células de la etapa (v) para explorar el espacio abierto de la cámara de recepción, y luego a la etapa (vi). En microcanal, poder migrar es principalmente generada por blebbing actividad como se ilustra en la figura 4, similar a la de ameboide cell. Formación de ampollas en la membrana celular y la deformación están totalmente grabada aquí. Figura 1. Esquema de fabricación del dispositivo de microfluidos. El proceso se lleva sobre una oblea de silicio 3-pulgadas mango a través de una técnica modificada de litografía blanda. 3-m de altura microcanales y marcadores de alineación se hacen como en la primera capa. Luego de 250 micras de espesor SU-8 es spin-revestido, mientras que los marcadores de alineación están cubiertos con cinta adhesiva, de modo que más tarde puede ser accesible para enmascarar alineador sin visión de bloqueo por fotorresistente gruesa. Por lo tanto, las características de la cámara se pueden hacer como la segunda capa y alineado con precisión a la primera capa. Sello PDMS es finalmente moldeada fuera el maestro resultante. Figura 2. Esquema de montaje del dispositivo y proceso de la siembra de células. Rodeada por PDMS y glcubreobjetos culo, el espacio de cultivo 3D se compone de cámaras, reservorios y microcanales. La cámara se llena con la siembra de cultivo de células, mientras que la cámara de recepción se llena inicialmente con medios libres de células. Los microcanales que se conectan entre ellos proporcionar rastro célula en migración de lado a lado receptor de la siembra. Figura 3. BTSC migración a través de microcanales. Alto: instantáneas de lapso de tiempo muestran una sola célula (resaltado en verde) migra sobre 400 micras desde el lado de la siembra para el lado de recepción. El viaje completo dura aproximadamente 2 días, que implica una serie de cambios morfológicos celulares. La barra de escala es de 40 m. Bajar: una representación de la historieta de seis etapas de migración. Previo a la migración (i): En cámara de siembra, las células en forma de huso y divisible se desplazan gradualmente a lo largo de la otra. Las células cerca de raza entrada de microcanal con cada otro por polarizante cuerpo celular y correo xerting saliente lamellipodia. Iniciación (ii): La célula migratoria con la más alta capacidad ocupa la entrada del canal, mientras que sus competidores van a retirarse. Ruta de exploración (iii): Los cambios en las células migratorias a un modo ameboide con polaridad. Este modo de migración es extremadamente móvil y capaz de explorar ruta de acceso en todas las direcciones por pequeñas protuberancias blebbing de membrana. Crucero (iv): Una vez que la ruta de migración se determina, la célula se transforma en un modo ameboide adaptada por el mantenimiento de un saliente adicional gran partida hacia delante. De esta manera, la célula mantiene una alta motilidad así como una dirección y velocidad constantes. Destino de exploración (v): Al final del camino, la célula se ralentiza y se desarrolla filopodias para explorar la cámara de recepción para cualquier objetivo invasión. Después de la migración (vi): Después de entrar en la cámara de recepción, célula se convierte en forma de estrella y retiene la motilidad alta, pero sin dirección determinada. "/> . Instantáneas de la figura 4 del lapso de tiempo muestran el ciclo de deformación blebbing actividad y la membrana de un BTSC: (AB). iniciación; (BD). Expansión; (DF). La retracción. Las flechas y las líneas de curva-representan la dirección y localización de la deformación de membrana, respectivamente. Las instantáneas se capturan cada 8 segundos.