区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

1。 BTSCの細胞解離 BTSCsは、ニューロスフェアとして、無血清幹細胞培地で増殖させ、既存の文化から派生しています。の文化は、以前10、11に記載されている。 BTSC由来神経球からの細胞懸濁液を準備します。 BTSC由来ニューロスフェアを15 mlコニカルチューブに回収し、5分間900rpmで遠心分離する。速く遠心せん断及び/又は損傷神経球ができます。上清を吸引し、ニューロスフェア培養は、あらかじめ温めておいたAccutase 0.5mlに再懸濁する。この溶液を、37℃で5〜10分間インキュベートする°Cの神経球が緩むようになります。細胞は機械的にP100のピペットの10月20日穏やかなストロークで破砕され、その後、幹細胞培地1.5mlをAccutaseを中和するために細胞に添加される。 BTSCsは、その後5分間1300rpmで遠心分離し、幹細胞培地1mlに再懸濁する。 50μlのアリコートをsuspensから削除されイオンと細胞計数のためのマイクロ遠心チューブに入れた。トリパンブルー50μlをエッペンドルフチュー​​ブに添加し、懸濁液は、細胞計数のために血球計数器に入れられます。 細胞計数した後、必要があれば別の幹細胞培地は20,000生細胞/μlの培地の細胞密度を与えるために、BTSC懸濁液に添加される。 2。二層SU-8マスターとPDMSスタンプの成形体の作製（図1を参照） 我々は、マイクロ流体デバイスの組立に不可欠であるSU-8マスターとPDMSスタンプを製作する光リソグラフィとソフトリソグラフィを使用しています。標準手順12よりわずかに異なる、私たちのSU-8マスターは2つの層で構成されています。 3μmの背の高いマイクロチャネルは、250μmの背の高い播種および収容室間に、プロセスの早い段階で、最初に/ボトム層にキャストされた第2 /上層にあります。 2つの培養コンパートメント（マイクロチャネル間の正しい接続のためにはsとチャンバー）、2つの層が正確な位置に整列する必要があります。しかし、第2の層の厚さと不透明度は底の機能へのアクセスを基準光/アライナを阻止するのに十分な大きさ。ここでは、リモートに配置されている基準マーカーとマスクを設計します。第二層を回転させながらこのように、第一層でこれらのマーカーは、選択的に遮断することができる。その結果、機能の両方の層は、1つのマスターで行われ、PDMSスタンプの浅浮き彫りで成形するための準備が整いました。 デザインと2フォトマスクを準備します。一つのマスクには、2つの基準マーカーと第一層のためのマイクロチャネルアレイ（400μmの長い10〜50μm幅）で構成されています。別のマスクは、第2層用チャンバー（2ミリメートル長いと600μm幅）をシードと受信で構成されています。両方のマスクは、イソプロパノール、空気乾燥で洗浄し、（薄い金属パーツ、コロラド州）透明フィルム上にレーザープリント、（アドビシステムズ社、カリフォルニア州）Illustratorでデザインされています。 を有する第1の層を作るSU-8フォトレジスト（マイクロケム、マサチューセッツ州）サプライヤーからの製品マニュアルに従って。まず、スピンコートSU-8（5）、3μmの厚いフォトレジストとハンドルウエハ（WRSの材料、カリフォルニア州）は、ソフトベーク続く。フォトレジストは、紫外線にさらされた、ポストベークと開発が続く密着で対応するマスク、その後で硬化です。 SU-8（2100）、厚さ250μmのスピンコート二層。第一層から基準マーカーをブロッキングから厚いフォトレジストを防止するために、我々は第二層のスピンコーティングの前にスコッチテープで、これらの分野をカバーしています。テープはアライメントの目的のためにマーカーを明らかにするために剥がされる。 紫外線露出する第二のマスクを持つ第二の層を。アライメントマーカーが明らかで、それは光マスクアライナを使用して第2のマスクの中にそれらを揃えるために簡単です。フォトレジストの第二の層は紫外線にさらされたと密着で硬化させ、ポストベークと開発が続いた後である。</ LI> 固着防止コートをもたらしマスター。硬化したPDMSの除去を支援するために、SU-8のマスターは、表面をテフロン加工の型のコーティングを作るために蒸着を介してシラン化することができます。単に真空下でトリクロロ（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シラン溶液を数滴と、少なくとも1時間はデシケーターに入れます。 マスターとPDMSをモールド。徹底的に10:1の比率で、PDMSシルガード184（ダウ·コーニング、ミシガン州）のプレポリマーをベースとcurerを混ぜる。空気の泡が見えなくなるまで真空脱ガスデシケーターに入れてください。新しい気泡が導入された場合、再びマスクとドガに混合物を注ぐ。それが室温に冷却した後90℃で2時間レベルのホットプレート上で金型を治す、優しくPDMSスタンプを離します。したがって、培養チャネルはPDMSに刻まれ、デバイスのアセンブリのための準備が整いました。外装にキズや着用されるまで、マスターは、成形のための再利用可能です。抗スティックコーティングが粘着性が回復したときに再度実行する必要があります。 3。マイクロ流体デバイスと細胞培養のアセンブリ（図2） 培養細胞へのために、機能彫りPDMSスタンプを同封のチャネルを形成するために、カバーガラスに装着されている。入口と出口は文化/メディアをロードするために作成されます。一方、ガラス基板とPDMSスタンプにクリーンアップやその他の手続きは、細胞の互換性を確保するために必要である。 生穴パンチャーを使用してPDMSスタンプを通して貯水池を作る。我々は彼らの直径が6ミリメートルであることを選ぶ。これらの貯水池は、2つの目的のために提供しています。ひとつは、細胞増殖のための余分な栄養素を保持することです。もう一つは、ピペットのロードと真空吸引のアクセスを行うためのものです。 30分間のエタノール70％PDMSスタンプを浸して、その後別の10分間脱イオン水ですすいでください。目的は、製造工程中に導入された、とPDMS汚染を架橋していない潜在的な有機残差をクリアすることです。そのような有機溶媒抽出13などより強烈かつ徹底的な洗浄プロセス</sup>とソックスレー抽出14は、他の場所で使用されていました。しかし、我々は、BTSC文化の中で、それが不要な発見。 オートクレーブ（121℃、35分）を使用して、PDMSスタンプを殺菌。このステップでは、さらに、PDMSの架橋反応が完了します。このステップから開始し、ステップ3.6になるまでは、すべての手順を無菌的に取られます。 PDMSスタンプを、以前にポリ-L-リジンでコーティングされたガラスカバースリップ上にレイアウトされています。デバイス15から17は、その後、37℃で一晩ラミニン溶液を用いてチャネル℃を充填することによってラミニンでコーティングされているラミニンは、デバイスから吸引され、デバイスは幹細胞培地で洗浄する。 貯水池やチャンネルにステップ1から細胞懸濁液をロードします。解離された細胞の11μlを1シード貯水池内に配置されます。真空吸引は、必要に応じて、播種チャンバーに細胞を強制的に使用されます。セルの追加の7μlを隣接播種リザーバーを配置されます。注：平均細胞密度は、20,000細胞/μlメディアです。アフトえー5分、播種および受信貯水池はメディアが殺到している。 上に0.5〜1ミリメートルプレオートクレーブしたPDMSシートを置きます。 2 PDMS片の間の天然発生表面接着は、細胞培養は、密閉と輸送、インキュベーション及び顕微鏡イメージングの準備ができていきます。 4。 BioStation IM（ニコンインスツルメンツ、メルヴィル、米国）と、BTSC移行の長期タイムラプスイメージング。 カメラを組み合わせることで、ソフトウェアやインキュベーターすべてが1ボックスに、この顕微鏡システムは、日間無妨害の画像細胞培養することが可能になります。また、そのユニークなモータの設計は、対物レンズを移動させ、ポイントを訪問し機能で静止試料ステージを保持します。これは、ハイスループットアッセイの画像平行実験とトラック細胞移動にそれが実用的です。 プリ平衡温度、湿気および空気供給を安定させるために45分間Biostation IMを。いくつかの水contの加算サンプルチャンバーにained料理は適切な湿度を維持するために使用されます。 顕微鏡の試料室にセル完結型のデバイスをロードし、その中心には、マイクロピンセットを使用しています。 Biostationソフトウェアにフォーカス、位置の点と時間点を設定し、時間経過を起動します。 5。代表の結果： 区分するマイクロ流体デバイスを用いて、癌細胞の遊走の目視検査および特性の例を図3と図4に示されている。セルラインは、BTSCです。我々の現在の設定では、細胞培養の位相画像を連続5日間（図3）のように長くて2秒ごとに（図4）と同じくらいの頻度で発生するように記録することができます。 5日間を超えて、培養培地を除去し栄養補給や廃棄のため交換する必要があります。当社の長期的な時間経過は、形態学的変化に基づいて、その移行時に6セルステージの回転順序を識別します。 illusとして図3にtrated、我々は、（i）は、移行前、（ii）の開始は、（iii）の経路探索、（iv）は、（v）の宛先exloration及び（vi）移行後の巡航としてそれらを記述します。受入室では、紡錘状の細胞は、成長分割と段階的に移行することができますバルクの腫瘍のように、（i）の段階にとどまる。彼らはマイクロチャネルの入り口に近づくと、彼らは接着剤突起を展開し、生成したとき、いくつかの細胞が段階（ii）に進みます。そのうちの一つだけが入場を占有し、移行の方向を探ることができ、段階（iii）に継続できるようになりました。セルが移動方向を決定したら、それは全体のマイクロチャネルを通って運ばれ、安定的かつ高速にマイクロチャネルを介してクルーズに（iv）のステージに進みます。収容室の開放的な空間を探索する段階（v）のマイクロチャネルは、細胞の収入の終わりに、次にステージ（VI）へ。マイクロ流路では、移行する電力は、主に、図4に示すように、活動をブレブ形成によってアメーバのセルと同様に生成されリットル。細胞のブレブ形成と膜変形​​は完全にここに記録されます。 図1：マイクロ流体デバイスの作製の模式図。全体のプロセスは、ソフトリソグラフィーの変更された技術によって、3インチシリコンハンドルウェーハ上に担持される。 3μmの背の高いマイクロチャネルとアライメントマーカーは第一層のように作られています。アライメントマーカーはスコッチテープで覆われている、250μmの厚さのSU-8は、後で厚いフォトレジストによって視力ブロックせずにアライナーをマスクするためにアクセスすることができるように、スピンコートする。これにより、チャンバーの機能は第2の層として作ることができ、正確に第一層に整列。 PDMSスタンプは、最終的に得られたマスターをオフに成形されている。 図2デバイスアセンブリと細胞播種プロセスの模式図。 PDMSとGLで囲まれたお尻のカバーガラスは、3D培養空間がチャンバー、リザーバおよびマイクロチャネルで構成されています。収納室が最初に細胞を含まない培地で満たされている間播種室は、細胞培養で満たされている。それらの間に接続するマイクロチャネルは、受信側に播種側からセル移行証跡を提供します。 図3マイクロチャネルを通じてBTSC移行。アッパー：タイムラプスのスナップショットは、単一のセル（緑色で強調表示されている）播種側から受信側には400μmにわたって移行を示しています。全体の旅は、細胞の形態学的変化のシーケンスを含む、約2日かかります。スケールバーは40μmである。下段：6移行段階の漫画表現を。移行前（ⅰ）：播種室では、紡錘形と割り切れる細胞が徐々にお互いに沿って移動。細胞体と電子の偏光によって互いにマイクロチャネル入り口のレースに近い細胞葉状突起をxerting。イニシエーション（ⅱ）：競合他社が撤退れながら、最高の能力を持つ遊走細胞は、チャネルの入り口を占めている。経路探査（III）：少し極性のアメーバモードへ遊走細胞に変化します。この移行モードでは、非常に運動性と小膜突起をブレブ形成することにより、すべての方向に経路を探索することができます。クルージング（IV）：移行パスが決定されると、細胞が前方に見出し追加の大突起を維持することにより、適応アメーバモードに変身。この方法では、細胞は、高い運動性だけでなく、安定した方向と速度を掲げています。デスティネーション·探査（V）：パスが終了すると、セルが遅くなり、いかなる侵略ターゲットの収納室を探索するfilopodiasを開発しています。移行後の（VI）：収納室を入力した後、細胞は、星形に変わり、高い運動性が、ないと判断の方向を保持します。 "/> （AB）：タイムラプスの図4スナップショットは、BTSCの活性と膜変形をブレブ形成のサイクルを示しています。開始、（BD）拡大;（DF）。後退。矢印やカーブの線はそれぞれ、膜変形の方向と位置を表しています。スナップショットは、8秒ごとに収集されます。