عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران
Summary
وهناك طريقة يمكن الاعتماد عليها لعزل الحمض النووي الريبي ل<em> الزائفة الزنجارية</em> تعافى من cecums الفئران الموصوفة. استعاد الجيش الملكي النيبالي هو كمية ونوعية كافية لqPCR اللاحقة ، التنميط النسخ ، والتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن تكييف هذه التقنية لعزل الحمض النووي الريبي من الميكروبات المعوية الأخرى.
Abstract
الزائفة الزنجارية نتيجة العدوى (السلطة الفلسطينية) في قسط كبير من المراضة والوفيات في المضيفين مع الجهاز المناعي للخطر ، مثل المرضى الذين يعانون من سرطان الدم وحروق شديدة ، أو زرع الأعضاء 1. في المرضى المعرضين للخطر عالية لتطوير التهابات مجرى الدم السلطة الفلسطينية ، والجهاز الهضمي (غي) المسالك هو الخزان الرئيسي للاستعمار 2 ، ولكن الآليات التي التحولات السلطة الفلسطينية من جرثومة استعمار an أعراض لالغازية ، وعادة ما يكون مميتا ، الممرض غير واضحة. سابقا ، وأجرينا في التجارب المجراة التنميط النسخ التي تتعافى من السلطة الفلسطينية مرنا الخلايا البكتيرية المقيمين في cecums المستعمرة 3 الفئران من أجل تحديد التغييرات في تعبير الجينات البكتيرية خلال التعديلات في حالة المضيف المناعية.
كما هو الحال مع أي نسخ التجربة التنميط ، في خطوة تحد من معدل في عزلة كميات كافية من مرنا ذات جودة عالية. بالنظر إلى وفرة من الإنزيمات ، والحطام ، وبقايا الطعام ، والجسيمات في الجهاز الهضمي ، والتحدي هو الحمض النووي الريبي من العزلة الرهيبة. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لعزل موثوق بها وقابلة للتكرار من الحمض النووي الريبي البكتيرية تعافى من الجهاز الهضمي الفئران. هذا الأسلوب يستخدم نموذجا راسخة الفئران الاستعمار GI السلطة الفلسطينية والعدلات المحرض نشر 4. وأكد غي الاستعمار مرة واحدة مع السلطة الفلسطينية ، والفئران ويتم استرداد محتويات الموت الرحيم والأعور والمجمدة فلاش. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مزيج من التعطيل والغليان الميكانيكية ، والفينول / كلوروفورم الاستخراج والمعالجة الدناز ، واللوني للتقارب. وأكد الكمية والنقاء بواسطة القياس الطيفي (Nanodrop تكنولوجيز) وbioanalyzer (اجيلنت تكنولوجيز) (الشكل 1). يمكن بسهولة هذا الأسلوب من الجراثيم GI RNA العزلة أن تتكيف مع غيرها من البكتيريا والفطريات كذلك.
Protocol
Discussion
طريقة استخراج الحمض النووي الريبي وصفها هنا يسمح لاسترداد كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة الزائفة الزنجارية تحصد من مجموع الجهاز الهضمي الفئران. لا يقتصر هذا الأسلوب لP. يمكن أن يحتمل الزنجارية ويمكن تطبيقها على غيرها من البكتيريا. فإن الانتعاش من الكائنات الجرثومية كافية من الأمعاء تختلف بشكل كبير من كائن إلى كائن. نموذجنا في الفئران ، P. الزنجارية تستوطن عادة في الجهاز الهضمي عند الفئران المستويات بين 5 × 07 حتي 05 أكتوبر × 10 8 CFU / ز 4 البراز. منذ محتويات انتشال ما يقرب من 0.5 الأعوري غرام ، ويقدر عدد P. الزنجارية انتشال اثنين من cecums بين 5 × 10 س CFU 07-05 أغسطس 10. إذا تم استخدام الكائنات الحية الدقيقة الأخرى ، سيكون من الحكمة أن تحقق مستويات GI الاستعمار ومن ثم حساب عدد cecums اللازمة لاسترداد العدد المستهدف من هراري. من المهم أيضا أن نلاحظ أنه عند استخدام هذا النموذج خاص الفئران ، الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية غير المصابين مع السلطة الفلسطينية ليس لديهم كميات قابلة للقياس الكمي من الحمض النووي الريبي معزولة عن محتوياتها الأعور.
لدينا نموذج الفئران من الاستعمار الزائفة الزنجارية الجهاز الهضمي ومحاولات نشر لمحاكاة المرضية P. تجرثم الدم في مرضى السرطان وزرع الخلايا الجذعية الزنجارية. في هذه الفئة من السكان المريض ، وغالبا ما يتم المنضب المتعايشة النباتات الثانوية للعلاج بالمضادات الحيوية أو العلاج الكيميائي (مثل استنزاف للمضادات الحيوية في النباتات المتعايشة GI) مما أدى إلى فرط نمو الميكروبات المسببة للأمراض (مثل أحادية بالاشتراك مع الزنجارية P.) ونشر بعد ذلك لاحقا بعد قمع المناعي. مزايا وقيود من هذا النموذج الفأري بالفعل تم تناولها سابقا 4. الغرض من هذه الدراسة الحالية هو تقديم منهجية لعزل الحمض النووي الريبي مجموع الميكروبية من الجهاز الهضمي. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا البروتوكول على نماذج الفئران الأخرى التي دراسة جوانب أخرى من الجراثيم المرضية في الجهاز الهضمي (أي النباتات المتعايشة التفاعلات والتأثيرات الجرثومية على مرض التهاب الامعاء ، الخ).
ميزة واحدة من هذا الأسلوب هو دمج خطوات متعددة بما في ذلك تجميد تحلل / ذوبان الجليد ، واختلال الميكانيكية (مع تحطيم التجانس ومدافع الهاون / مدقة) ، الغليان ، وتحلل المواد الكيميائية (مثل الحزب الديمقراطي الصربي). على الرغم من العديد من الخطوات تحلل ، قد تكون بعض الكائنات الحية الدقيقة (لاسيما إيجابية الجرام البكتيريا والفطريات / الخميرة) تتطلب تعطيل ميكانيكية إضافية. وينبغي بعد الساخنة تحلل / حامض الفينول كلوروفورم الحضانة (الخطوة 3.5) ، وبالإضافة إلى ذلك من الخرز (0.1 ملم للبكتيريا و / أو 0،5-0،7 مم للخميرة) والخطوة اللاحقة حبة الضرب يكون كافيا لهذه الكائنات ليز 9 ، 10.
نظرا للطبيعة المعقدة للمواد المستخرجة من الفئران الأعور ، وكرر الباردة acid-phenol/chloroform الاستخراج (الخطوة 3،7-3،9) مطلوبة للغاية من أجل تحقيق الجودة ومقبولة رنا سلامة المصب لتفاعلات أخرى. وقد بين 3-5 قلع acid-phenol/chloroform الباردة يلزم قبل واجهة بيضاء بين المرحلتين المائي والعضوي هو القضاء. أخيرا ، فإن الجمع بين كل من العلاج والدناز (الخطوة 4) وبروتوكول RNeasy تنظيف (الخطوة 5) ضرورية لإزالة تلويث الحمض النووي والصغيرة غير مرنا (5S والحمض الريبي النووي النقال). كما ذكر سابقا ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي تعافى هذا البروتوكول هو كمية ونوعية كافية لتحديد ملامح النسخ اللاحقة 3 ، qPCR (غير منشورة) ، والجيش الملكي النيبالي التجارب تسلسل (غير منشور).
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI62983 (AYK) ، AI22535 (الباوند).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
| Homogenizer | Omni | TM-125 |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
| DNase | Ambion | AM2238 |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
Riferimenti
- Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. Infections caused by Pseudomonas aeruginosa. Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).
- Bertrand, X. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units. Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).
- Koh, A. Y. Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination. PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).
- Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia. Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).
- Alexander, R. J., Raicht, R. F. Purification of total RNA from human stool samples. Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).
- Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR. J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 20, 968-970 (1996).
- Schroeder, A. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).
- Turnbaugh, P. J. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 457, 480-484 (2009).
