FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid
Summary
Functie-Spacer-Lipid (FSL) constructies kan de oppervlakte-eigenschappen van levende cellen en virions worden gewijzigd zonder verlies van vitaliteit. De methode vereist slechts een eenvoudige aanraking van een FSL bouwen oplossing met een cel / virion en spontaan en stabiele ondergrond incorporatie optreedt.
Abstract
De mogelijkheid om te wijzigen / visualiseren biologische oppervlakken, en vervolgens de studie van de gewijzigde cel / virion in een reeks van in vitro en in vivo omgeving is essentieel voor het verkrijgen van meer inzicht in de functie van specifieke moleculen of het gehele entiteit. Studies van biologische oppervlakte modificatie zijn over het algemeen beperkt tot de genetische manipulatie van het organisme of de covalente koppeling van chemische groepen aan het celoppervlak 1,2. Maar deze traditionele technieken bloot de cel chemische reactanten, of ze zijn aanzienlijke manipulatie om het gewenste resultaat te bereiken, waardoor ze lastig, en ze kunnen ook ongewild invloed hebben op de levensvatbaarheid / functionaliteit van de gewijzigde cel. Een eenvoudige methode om onschuldig te wijzigen het oppervlak van cellen is vereist.
Onlangs is een nieuwe technologie, heeft Kode Technology introduceert een reeks van nieuwe constructies bestaande uit drie componenten: een functionele kopgroep (F), een spacer (S) en een lipide staart (L) en staan bekend als functie-Spacer-Lipid of FSL constructs3. De spacer (S) is geselecteerd om een constructie die is dispergeerbaar in water te voorzien, maar toch zal spontaan en stabiel op te nemen in een membraan.
FSL construct functionele groepen (F) tot nu toe onder andere een reeks van sacchariden waaronder bloedgroep determinanten met betrekking tot, siaalzuren, hyaluronan polysacchariden, fluoroforen, biotine, radiolabels, en een reeks van peptiden 3-12. FSL constructies zijn gebruikt bij het wijzigen embryo's, zaadcellen, zebravis, epitheliale / endometriumcellen, rode bloedcellen, en de virionen aan kwaliteitscontroles systemen en diagnostische panelen, te creëren om celadhesie / interactie / scheiding / immobilisatie te wijzigen, en voor in vitro en in vivo beeldvorming van cellen / virionen 3-12.
Het proces van de aanpassing van cellen / virionen is generiek en uiterst eenvoudig. De meest gebruikelijke procedure is incubatie van de cellen (in lipiden gratis media) met een oplossing voor het FSL bouwt gedurende 1-2 uur bij 37 ° C 4-10. Tijdens de incubatie de FSL constructies spontaan op te nemen in het membraan, en het proces is voltooid. Wassen is optioneel. Cellen die zijn gemodificeerd door FSL constructies staan bekend als kodecytes 6-9, terwijl de virionen zijn kodevirions 10.
FSL bouwt als directe infusies en kodecytes / kodevirions zijn gebruikt in experimentele diermodellen 7,8,10. Alle kodecytes / kodevirions lijken hun normale vitaliteit en functionaliteit te behouden, terwijl het verkrijgen van de nieuwe functie van de F-groep 7,8,10,11.
De combinatie van dispersie in biocompatibele media, spontane opname in celmembranen, en schijnbare lage toxiciteit, maakt FSL bouwt waardevolle research tools voor de studie van cellen en virionen.
Protocol
Discussion
Het wijzigen van cellen en virionen met FSL constructies is een zeer eenvoudige en robuuste techniek 3-11. Te beschrijven en te onderscheiden FSL bouwen gemodificeerde cellen en virionen van niet gemodificeerde cellen, worden ze genoemd kodecytes en kodevirions respectievelijk 6-10, maar alleen wanneer de geïntroduceerde functionele groep kan worden aangetoond om aanwezig te zijn op hun membraan. Wanneer kodecytes zijn gemaakt met verschillende concentraties van FSL constructies, kunnen ze worden aangeduid met de concentratie van de FSL construct-oplossing gebruikt om ze te maken, bijvoorbeeld 15 ug / ml A kodecytes, of als meer dan een FSL wordt dan gebruik gemaakt van een gecombineerd term, bijvoorbeeld A + biotine kodecytes 7,8. Bij de verschillende cellen moeten worden vergeleken, met inbegrip van het celtype in de beschrijving wordt aanbevolen, bijvoorbeeld rode bloedcellen biotine kodecytes of endometrium biotine kodecytes 7,8.
Hoewel het proces van inbrengen is zeer robuust en het inbrengen (zij het met verschillende tarieven) zal plaatsvinden over een groot temperatuurbereik 4 tot 37 ° C en binnen minuten tot uren, tot reproduceerbare inbrengen strikte controle van contact tijd, temperatuur, FSL de concentraties ( inclusief verdunningsmiddel formulering), en in mindere mate cel concentratie vereist. Tot op heden zijn alle FSL constructen kunnen worden gebruikt om cellen te wijzigen door dezelfde techniek 4-11, maar het wordt verwacht dat bepaalde voorwaarden gunstiger zijn voor work-flow en / of op de optimale afhandeling eisen van de cellen / virions te worden gewijzigd . De exacte FSL concentratie om het gewenste effect te bereiken moet worden bepaald door de gebruiker 4. De resulterende FSL construct gemodificeerde cellen / virionen kan meestal worden gebruikt in dezelfde wijze als een niet-gemodificeerde cellen / virion in biologische of analytische systemen 4-11. Als het FSL bouwt langzaam elueren van gemodificeerd oppervlakken wanneer ze in contact met de lipide-oplossingen 7,8, of worden geconsumeerd door actieve cellen 11, moeten deze problemen worden met betrekking tot het niveau van signaal of activiteit verkregen over periodes van tijd. Kodecytes kan worden vastgesteld (bijv. glutaaraldehyde / formaline) na het inbrengen op voorwaarde dat de fixeermiddel niet lipide-eluting oplosmiddelen bevatten en de functionele groep is compatibel met het fixeermiddel. Als alternatief vaste cellen kunnen worden gewijzigd met FSL constructen.
In aanvulling op de wijziging van de cel en virion oppervlakken FSL constructen kunnen ook direct worden toegediend in de circulatie van proefdieren veroorzaken in vivo modificatie van circulerende cellen 7 en 12 om virussen, giftige stoffen, 12 en 7 antilichamen remmen. FLS bouwt zijn ook gebruikt om liposomen versieren en kunnen worden afgedrukt op papier oppervlakken 13, waar ze immobiliseren, en kan vervolgens worden gebruikt in diagnostische assays.
De mogelijkheid om eenvoudig te wijzigen levende cellen met een toenemend aanbod van FSL constructies moet een nuttig onderzoek en ontwikkeling hulpmiddel voor de studie van celoppervlak biologie worden.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Dan Bess van Sigma-Aldrich voor het presenteren van de video. We danken ook Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, en Eleanor Williams voor hun resultaten en bijdragen aan het ontwerp, de synthese van FSL constructies en het bepalen van biologische activiteit.
Materials
| Sigma product number | Sigma name | Construct (KODE Biotech name) |
| F9307 | FSL-A(tri) | FSL-A(GALNa3[Fa2]GALb)-SA1-L1 |
| F9557 | FSL-B(tri) | FSL-B(GALa3[Fa2]GALb)-SA1-L1 |
| F9807 | FSL-GB3 | FSL-GB3(GALa4GALb4GLCb)-SA1-L1 |
| F9682 | FSL-Lea(tri) | FSL-LEA(GALb3[Fa4]GLCNb)-SA1-L1 |
| F9182 | FSL-biotin | FSL-CONJ(1Biotin)-SC2-L1 |
| F9432 | FSL-Galili | FSL-GALILI(GALa3GALb4GLCNb)-SA1-L1 |
| F1058 | FSL-Fluorescein | FSL-FLRO4(fluorescein)-SA2-L1 |
Table 1. Commercially available FSL constructs described in this paper.
Riferimenti
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Strable, E., Finn, M. G. Chemical modification of viruses and virus-like particles. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).
- Henry, S., Bovin, N. The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells. Transfusion. 48, 194A-194A (2008).
- Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes. Transfusion. 47, 876-882 (2007).
- Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids. Vox Sang. 95, 180-180 (2008).
- Henry, S. Modification of red blood cells for laboratory quality control use. Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).
- Oliver, C., Blake, D., Henry, S. In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model. Transfusion. , (2011).
- Oliver, C., Blake, D., Henry, S. Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes. Transfusion. , (2011).
- Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes. Transfusion. 50, 635-641 (2010).
- Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions. J Virol Meth. 10, (2011).
- Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. Fluorophore-kodecytes – fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses. FEBS J.. 277, 199-199 (2010).
- Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms. Glycobiology. 27, 515-524 (2010).
- Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens. FEBS J. 277, 235-235 (2010).
- Lan, C. -. C. . Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]. , (1988).
