からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em>ハマダラカ</em>属。

蚊のDNA抽出質（ 図1）、 ハマダラカarabiensis分子の同定（ 図2）とPのためのPCRアッセイからの結果の例簡略化されたChelex法ははるかに少ない手順（ 表1）にもかかわらず、プロトコル10を塩析標準と同様の結果が得られることを熱帯熱検出（ 図3）を表示します。それぞれの抽出液に匹敵するDNAの品質で、それは驚くべきことではないことに対するサンプル陽性率。ハマダラカ同胞種だけでなく、寄生虫感染率はマクネマーのカイ二乗検定（ 図3）に基づいて、統計的に差は認められなかった。 感度（％）は次のように計算されたTP /（TP + FN）TPは真の陽性を示し、FN​​は偽陰性を示している* 100。特異性（％）は、TN /のように決定したTNは真の陰性を示し、FPは偽陽性を示し（TN + FP）* 100、。 DNAの品質（ND4）PCRは、設立されるようにプロトコルを塩析金本位制に比べChelexアプローチのための93％の感度と82％の特異性を示した。感度と特異度の対応する値は Pのために、それぞれの兄弟種同定、PCRと92％と80％を使用して、それぞれ100％と78％であった熱帯熱マラリア原虫検出PCR。 反応混合物にBSAの添加は、簡略化さChelexと正規両方のプロトコルを塩析するため、PCR阻害物質による14の救済へのPCR陽性（ 図3）の一般的な増加をもたらした。しかし、この増加はChelex抽出した（p = 0.039）上のDNAの質（ND4 PCR）を除いて統計的に有意ではなかった。 P上の対立遺伝子特異的制限酵素消化熱帯熱マラリア DHFRは（または他の標的遺伝子）アンプリコンは、薬剤抵抗性対立遺伝子（;唾液腺のデータは示されていない図4）の中腸及び唾液腺マラリア感染症の遺伝子タイピングを可能にします。 <table border = "1"> シンプルChelex手順 標準では、手順を塩析 手順 試薬 手順 試薬 1.5 mlのマイクロチューブに検体を追加し、1×PBS / 1％サポニン溶液（2分）100μlにホモジナイズする。 20分間室温で残す。 2分間20,000 xgでスピンし、上清を捨てる。 1X100μlのPBSを加え、一瞬（3秒）ボルテックスで静かに混和する。 2分間20,000 xgでスピンし、上清を捨てる。 脱イオン水および75μlの滅菌脱イオン水で20％（w / v）のChelex25μlを追加します。 10分間ホット、無菌の23G注射針、沸騰管内容物を使用して、サンプルチューブの蓋にピアスの穴。 2で微量遠心チューブをスピン1分間0000 xgで。 使用するまで-20℃（25μlのPCR反応液に2.5μL）で標識し、無菌バイアルと店舗DNA溶液に上清を移してください。 PBS サポニン Chelex-100ビーズ 1.5 mlのマイクロチューブに検体を追加し、1％のDEPC（2分）で100μlベンダーバッファー*でホモジナイズする。 1時間65℃でインキュベートする。 15μlの冷8Mの酢酸カリウムを追加します。穏やかに混合し、45分間氷上でインキュベートする。 10分と新しい1.5 mlチューブに上清を転送するために20,000 xgでマイクロチューブにサンプルをスピン。 100％エタノールを250μlを加え、チューブを反転してよく混ぜる。 室温で5分間静置して下さい。 15分間20,000 xgでサンプルをスピン。 吸引し、上清を捨て、ペレットがチューブ（30メートルで完全に乾かし残し）インチ 4℃で一晩0.1×SSC +アーゼ（10μg/ ml）を20μlにペレットを再懸濁し℃、 使用するまで-20℃で80μlのDEPC水とストアを追加します。 ジエチル（DEPC） *ベンダーバッファ： 0.1MのNaCl 0.2 Mショ糖 0.1Mトリス-HCl 0.05 M EDTA、pH9.1の DEPC水で0.5％のSDS 8 M酢酸カリウムエタノール 0.1X食塩クエン酸ナトリウム（SSC）は、バッファリボヌクレアーゼ（10μg/ ml）を合計時間：37分合計時間：2時間47分、プラス一晩 表1。シンプルChelexプロトコル用試薬および時間要件のステップ比較によりステップとスタンドARDは蚊の標本からDNAを抽出するための方法を塩析。 ハマダラカarabiensisフィールドサンプルの"M"の抽出物を塩析簡略化Chelex "C"と標準からのDNAの質の1。ND4ミトコンドリアPCRの比較図 。ノースカロライナ、ネガティブコントロール、M1とC1、C2、M2と、M3とC3、およびM4とC4は、塩析と同じからChelex抽出対になっています。 arabiensisの蚊の標本。 L、100 bpのDNAラダー。 。。ハマダラカarabiensis C1とM1、C2とM2は、C3とM3、C4およびM4は同じ蚊の標本のために"M"と簡略化しChelex "C"のDNA抽出物を塩析からそれぞれのアンプリコンを示すために、図2分子の同定、PCR、AR、 ハマダラカarabiensisポジティブコントロール、L、100 bpのDNAラダー。 図3 Chelexとハマダラカarabiensis（AR）10、節足動物NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子4（ND4）DNAの品質テスト11、葉酸薬剤耐性Pの分子同定のためのPCRアッセイと、蚊フィールドサンプルのDNA抽出、塩析で陽性の検出。熱帯熱マラリア DHFR遺伝子タイピング12（F-M4）。反応混合物中のBSAの有無にかかわらず実行するアッセイのために示された結果。マクネマーのカイ二乗検定は、DNAからポジティブPCRのパーセントの違いが簡素Chelexとプロトコルを統計学的に有意であった塩析標準から抽出されたかどうかを判断するために使用されていました。 <strong>図4：タイピングPに簡略化されたChelexプロトコルの応用薬剤抵抗性対立遺伝子のために蚊の原虫感染症（中腸のデータが示されている）。 Pのコドン108に隣接するリコンにBstN私は消化熱帯熱マラリア DHFR遺伝子12は蚊サンプル（;半ば腸データは示さM1〜M5）でcycloguanil耐性S108T変異体を示しています。 U、未消化の522 bpのアンプリコン; FCR3、実験室標準P. S108Tを運んで熱帯熱マラリア原虫陽性対照クローン、K1、P.熱帯熱マラリア原虫実験室標準cycloguanilセンシティブS108Nを保有するクローンネガティブコントロール、L、100 bpのDNAラダー。