Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em> Anopheles</em> Spp.

Voorbeelden van resultaten van PCR assays voor mug DNA extract kwaliteit (figuur 1), Anopheles arabiensis moleculaire identificatie (figuur 2) en P. falciparum detectie (figuur 3) blijkt dat de vereenvoudigde Chelex werkwijze vergelijkbaar resultaat levert het standaard protocol uitzouten 10, ondanks veel minder stappen (tabel 1). Met vergelijkbare DNA-kwaliteit in de betreffende extracten is het niet verwonderlijk dat monster positiviteit tarieven met betrekking tot een. gambiae broertje soorten en parasitaire infectie tarieven waren niet statistisch verschillend op basis van McNemar-chi-kwadraat test (Figuur 3). Gevoeligheid (%) werd berekend als TP / (TP + FN) * 100, waar TP betekent het ware positieven en valse negatieven FN geeft. Specificiteit (%) werd bepaald als TN / (TN + FP) * 100, waar TN betekent het ware negatieven en FP geeft valse positieven. De DNA kwaliteit (ND4) PCR toonde 93% sensitiviteit en 82% specificiteit voor de Chelex benadering ten opzichte van de gevestigde uitzoutingsconstante protocol als gouden standaard. Corresponderende waarden van gevoeligheid en specificiteit was 100% en 78%, respectievelijk met sibling soortidentificatie PCR en 92% en 80%, respectievelijk P. falciparum detectie PCR. De toevoeging van BSA aan reactiemengsels tot een algemene verhoging van PCR positieve (figuur 3) door verlichting van PCR remmers 14 voor zowel de vereenvoudigde Chelex en regelmatige uitzouten protocol. Deze toename was niet statistisch significant behalve DNA kwaliteit (ND4 PCR) op Chelex extracten (p = 0,039). Allelspecifieke restrictie-enzymdigestie op P. falciparum DHFR (of andere doelgen) amplicon kan de genotypering van mid-darm en speekselklier malaria infecties resistentie allelen (figuur 4; speekselklier data niet getoond). <table border = "1"> Eenvoudige Chelex Procedure Standaard Zouten uit Procedure Stappen Reagentia Stappen Reagentia Toevoegen specimen tot 1,5 ml microfugebuis en homogeniseer in 100 pi 1X PBS / 1% saponine-oplossing (2 min). Reactie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Spin bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant. Voeg 100 ul van 1X PBS toe en meng voorzichtig door kort vortexen (3 sec). Spin bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant. Voeg 25 ul van 20% w / v Chelex in gedeïoniseerd water en 75 pi steriel gedemineraliseerd water. Pierce opening in deksel monsterbuis met hete steriele 23G naald en kook buisinhoud gedurende 10 minuten. Spin microfugebuisje op 20000 xg gedurende 1 min. Breng supernatant in steriele prelabeled flesje en bewaar DNA oplossing bij -20 ° C tot gebruik (2,5 ul in 25 ul PCR reactie). PBS Saponine Chelex-100 kralen Toevoegen specimen tot 1,5 ml microfugebuis en homogeniseer in 100 ul buffer Bender * met 1% DEPC (2 min). Incubeer bij 65 ° C gedurende 1 uur. Voeg 15 ul koude 8 M kaliumacetaat. Meng voorzichtig en incubeer op ijs gedurende 45 minuten. Spin monster in microfugebuizen bij 20.000 x g gedurende 10 min en overdracht supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis. Voeg 250 ul 100% ethanol en meng goed door het buisje. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Spin monsters bij 20.000 x g gedurende 15 minuten. Aspireren en verwijder het supernatant, waardoor de pellet volledig opdrogen in de buis (30 min). Hersuspendeer pellet in 20 ul 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) gedurende de nacht bij 4 ° C. Voeg 80 pl DEPC water en bij -20 ° C tot gebruik. Diethylpyrocarbonaat (DEPC) * Bender Buffer: 0,1 M NaCl 0,2 M Sucrose 0,1 M Tris-HCL 0,05 M EDTA, pH 9,1 0,5% SDS in DEPC water 8 M kaliumacetaat Ethanol 0,1 x Saline natriumcitraat (SSC) buffer RNAse (10 ug / ml) Totale tijd: 37 min Totale tijd: 2 uur 47 min, plus girale Tabel 1. Stap voor stap vergelijking van de reagentia en de tijd eisen voor eenvoudige Chelex protocol en staanard uitzoutingsconstante methode voor DNA-extractie van muggen exemplaren. Figuur 1. ND4 mitochondriale DNA PCR vergelijking van de kwaliteit van vereenvoudigde Chelex "C" en standaard uitzouten "M" extracten Anopheles arabiensis veldmonsters. NC, negatieve controle, M1 en C1, M2 en C2, M3 en C3, en de M4 en C4 zijn gekoppeld zouten uit en Chelex uittreksels uit dezelfde An. arabiensis mug specimens. L, 100 bp DNA ladder. Figuur 2 Moleculaire identificatie PCR voor Anopheles arabiensis C1 en M1, M2 en C2, C3 en M3, M4 en C4 duiden respectieve amplicon van uitzouten "M" en vereenvoudigde Chelex "C" DNA extracten dezelfde mosquito specimens;.. AR, Anopheles arabiensispositieve controle, L, 100 bp DNA-ladder. Figuur 3. Detectie van positieven, op Chelex en zouten uit DNA-extracten voor muggen veldmonsters, met PCR assays voor de moleculaire identificatie van Anopheles arabiensis (AR) 10, geleedpotigen NADH dehydrogenase-gen 4 (ND4) DNA-kwaliteit te testen 11 en antifolaat resistentie P . falciparum DHFR genotypering 12 (F-M4). resultaten getoond voor assays uitgevoerd met of zonder BSA in het reactiemengsel. McNemar-chi-kwadraattest werd gebruikt om te bepalen of de verschillen tussen percentage positieve PCR van DNA geëxtraheerd uit de vereenvoudigde Chelex en de standaard uitzouten protocollen waren statistisch significant. <strong> Figuur 4. Toepassing van vereenvoudigde Chelex protocol in genotypering P. falciparum-infecties in muggen (midden-gut-gegevens weergegeven) voor resistentie allelen. BstN ik vertering op amplicon flankerende codon 108 van de P. falciparum DHFR gen 12 toont cycloguanil-resistente S108T mutanten in mug monsters (M1-M5, mid-gut-gegevens weergegeven). U, onverteerd 522 bp amplicon; FCR3, laboratorium standaard P. falciparum positieve controle kloon die S108T, K1, P. falciparum laboratorium standaard kloon negatieve controle uitvoeren cycloguanil-gevoelige S108N, L, 100 bp DNA-ladder.