Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

1. Preparação prévia das soluções de reserva Prepare duas soluções estoque de solução de Tyrode do (16x) de antecedência em água deionizada e armazená-los a 4 ° C: Ações I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher Lawn, científico Fair, NJ)); Estoque II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). Preparar soluções estoque de corantes fluorescentes. Para evitar congelamento e descongelamento repetidos, nós armazenamos 30 mL alíquotas de ambos os corantes a -20 ° C, o que é suficiente para uma experiência: Sensíveis à voltagem solução estoque de corante RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,25 mg / mL em dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); Cálcio indicador Rhod-2:00 solução-mãe (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mg / ml de solução em DMSO. Prepare excitação-contração desacoplador solução estoque blebbistatin (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / mL em solução de DMSO) de antecedência e guardar o blebbistatin dissolvida a 4 ° C. 2. Preparar soluções de perfusão e configuração experimental 7 Recém preparar solução Tyrode 2L do (128.2mM NaCl, 1,3 mM CaCl 2 (2H 2 O), 4,7 mm KCl, 1,05 mm MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, NaHCO 20mM 3, 11,1 mM de glicose-D em água deionizada, pH = 7,35 ± 0,05). Se a solução de ações está sendo usado para fazer 2L de solução de Tyrode do (suficiente para um experimento) Tomar 1750 mL de água deionizada e misturar em 125 mL de Ações I, 125 mL de Ações II, e 4g de glicose. Ligue as duas bombas dos sistemas de perfusão. Definir a bomba peristáltica (Peri-Star, WPI, Sarasota, EUA) que é usado para perfusão retrógrada a 40 mL / min. Definir a bomba peristáltica outros (Cole-Parmer Masterflex Bomba Peristalic L / S, empresa Instrumento Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois) que é usado para superfusão e devolver o perfusato de volta para o reservatório de exploração para 80 mL / min. Lavar o sistema de perfusão com etanol 70% por 30 min e depois com água deionizada 2L. Uma vez que toda a água deionizada é evacuada da câmara, circula a solução Tyrode e passá-lo através de um filtro 5 mícrons (Millipore, Billerica, MA, EUA). Aqueça o perfusato a 37 ° C com uma jaqueta de água e circulador (ThermoNESLAB EX7, Newtown, EUA) e do perfusato a oxigenar por borbulhamento O 2 / CO 2 (95% / 5%) de gás na solução. Monitorar o pH da solução com um medidor de pH (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) e ajustar a taxa de O 2 / CO 2 borbulhando para manter o pH em 7,35 ± 0,05. Continue pHmetria e temperatura durante o experimento. O aparelho de mapeamento de dupla óptica consiste em duas Micam Ultima-L CMOS câmeras (SciMedia, Costa Mesa, CA), que têm alta espacial (100×100 pixels, 230 ± 20 mM por pixel) e resolução (1.000-3.000 frames / seg) temporal. Fixar um filtro passa-banda (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) na frente da câmera designada imagem de cálcio, enquanto que, um filtro passa-tempo (> 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) precisa ser posicionado na frente da câmera designada tensão de imagem. As câmeras são dispostos perpendicularmente uns aos outros por um titular, que contém um espelho dicróico (635 nm de corte, Omega Optical, Brattleboro, VT). Imediatamente abaixo do titular câmera dupla, há uma lente (Nikon Nikkor 55 milímetros 1:1.4 235.052), que concentra a emissão de luz que vem do coração para o espelho dicróico. A distância de trabalho é de aproximadamente três centímetros. A luz de excitação é gerada por uma lâmpada halógena (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) e é transmitida através de um filtro de calor, obturador, e filtro passa-banda (520 ± 45 nm). A guia de luz flexível direciona a luz passa-banda filtrada para a preparação, e um obturador é usada para garantir que a preparação é exposto à luz apenas durante a aquisição de imagem para evitar fotodegradação dos corantes. Prepare Ag / AgCl 2 eletrodos para estimulação e detecção antecipada e instalá-los na câmara antes de colocar o coração. Certifique-se que amplificadores e filtros são ajustados para níveis apropriados. 3. Colheita do coração mouse, canular e configurar perfusão Langendorff Anestesiar o rato com cetamina / xilazina (cetamina, 80mg/kg de peso corporal; xilazina, 10 mg / kg) e heparina (100 unidades) por injeção intraperitoneal. Assegurar um nível adequado de anestesia com a falta de reflexo de dor. Após uma incisão médio-esternal, remover rapidamente o coração e lave-o em oxigenada (95% O 2, 5% CO 2), a temperatura constante (37 ± 1 ° C) solução Tyrode é. Usando um microscópio de dissecação, Identificar rapidamente a aorta e fazer um corte limpo em toda a aorta ascendente abaixo da artéria subclávia direita. Uma pequena secção de aorta é então ligado a uma custom made 21 calibre da cânula com uma ponta queimado. Fio de seda preto trançado 4-0 (Corporação especialidades cirúrgicas, Reading, PA) é usado para corrigir o coração para a cânula. Após canulação, o coração é perfundido retrogradamente e superfused com solução Tyrode é. A taxa de perfusão retrógrada é ajustado na faixa de 2-5 mL / min para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 mmHg (transdutor de pressão, instrumentos de precisão Inc Mundial (WPI), Sarasota, EUA; Ponte Amplificador TBM4M, WPI, Sarasota, EUA). Depois que o coração é canulada, pulmão, timo, tecido adiposo e são, então, dissecados e removidos. O coração isolado é preso (Ferramentas Ciência Fine) no ápice para a parte inferior da câmara de perfusão (revestido Sylgard) para evitar fluxo induzido por movimento. Os apêndices atriais direito e esquerdo também são esticados e presos (Ferramentas Ciência Fine, Inc, Foster City, CA) para o fundo da câmara, que fornece superfície máxima para medidas ópticas dos átrios. Muito importante! Um pequeno tubo de silicone é inserida no ventrículo esquerdo através das veias pulmonares e fixado por fio de seda para o tecido conjuntivo nas proximidades. Isso evita que o congestionamento solução e acidificação do perfusato preso no ventrículo esquerdo, que é especialmente importante após a supressão das contracções ventriculares com um desacoplador excitação-contração (consulte a etapa Parte 4 19). Um eletrodo feito sob medida é colocada sobre a superfície do coração para conduzir os estímulos ritmo, que é gerado pelo Mestre-8 (AMP Instruments Ltd, Jerusalém, Israel) ou 26T PowerLab (AD Instruments, Sydney, Austrália). A tampa de vidro de pequeno porte é fixa na superfície da solução sobre o coração para reduzir artefatos de movimento a partir da solução de vibração. O foco da luz de excitação sobre o coração. Além disso, ajustar a distância entre o aparelho de câmara dupla e do coração para que a resolução máxima será obtido. Desligar todas as luzes na sala e iniciar as gravações elétrica usando PowerLab 26T. 4. Tensão de carga de cálcio e corantes sensíveis e excitação-contração desacoplador Warm-up de 0,6 mL blebbistatin. Misture 0,5 mL da blebbistatin com o perfusato no reservatório de retenção. Diluir a 0,1 mL restantes de blebbistatin em 1 mL de solução de Tyrode e injetá-la lentamente (ao longo de um período de 20 minutos) através de uma porta de drogas localizado perto da cânula. Observe como blebbistatin reduz gradualmente o artefato de movimento. Diluir 30 mL da solução estoque de tensão sensíveis corante RH237 em solução 1 mL Tyrode e injectar lentamente ao longo de 5-7 minutos na porta de injeção mesma blebbistatin. 30 mL de cálcio indicador Rhod-02:00 01:01 é misturado com PLURONIC F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, solução a 20% em DMSO) e, em seguida, diluídas em 1 ml de solução Tyrode e lentamente aplicado sobre min 10/05, através da porta de injeção mesmo . Aguarde 5-10 minutos para blebbistatin e corantes para alcançar a membrana celular e citoplasma. Continue com o protocolo quando o movimento é completamente suprimida. Continuamente gravações monitor ECG sobre todo o procedimento para garantir a função elétrica normal do coração. Iniciar as gravações usando o sinal fluorescente SciMedia custom software (SciMedia, Costa Mesa, CA). 5. Resultados representativos: Figura 1. Instalação experimental para a perfusão, gravações elétricas e mapeamento óptico. EM = emissões; Lp = longpass Figura 2. Preparação Experimental e exemplos sinal gravado durante a estimulação ventricular. Esquerda: Os sinais de ECG são coletados de Ag / AgCl dois eletrodos de disco (Top) e um exemplo de S1S1 protocolo de estimulação é mostrado (Bottom). Center: Langendorff preparação do coração mouse. Direita: Representante potenciais de ação óptica e sinais de cálcio transiente de átrios (Top) e ventrículos (Bottom) são mostrados. A seta amarela (Top) aponta para a dispersão de sinal fluorescente vinda dos ventrículos, que é visto nas gravações atrial. LV = ventrículo esquerdo, VD = ventrículo direito; LA = átrio esquerdo; RA = átrio direito Figura 3. Representante gravações ópticas de V m e CAT dos ventrículos do coração selvagem do tipo de mouse. A. A preparação experimental com uma série de pontos espaçados marcada por pontos pretos, cuja óptica gravações pode ser visto em (C). Exemplo B. rastreamento de V m eo gato de uma localização central na matriz (ver caixa in (C)). C. V m (azul) e CAT (vermelho) da série de pontos espaçados. Sinais foram binned 3×3. Figura 4. Mapa de ativação e de condução. A. Um mapa de ativação exemplo de um coração selvagem do tipo de mouse com transversal (T) e (L) longitudinal direções indicadas pelas setas brancas. Sinais B. V m (Top) e dV / dt (Bottom), correspondentes aos três pontos de vista em A (T1, T2, T3, L1, L2, L3). Figura 5. Potencial de ação e de cálcio análise de duração transitória. A. duração Ação potencial de 80% repolarização (APD80) e duração de cálcio transiente menos 80% de relaxamento (CaD80) mapas são mostrados de um coração em condições controle (esquerda) e depois de 30 nM isoproterenol aplicação (Direito). A cor amarela / verde nos ventrículos (direito) indica isoproterenol encurtado APD80 e CaD80. Exemplo B. traçados de APD80 e CaD80 dos ventrículos do tipo selvagem mouse (Top) e átrios (Bottom).