Mappatura ottico dei potenziali d'azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

1. Preparazione avanzata delle soluzioni madre Preparare due soluzioni stock di soluzione di Tyrode (16x) in anticipo in acqua deionizzata e conservarli a 4 ° C: Magazzino I (119,872 g / L di NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L di KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher scientifico, Fair Lawn, New Jersey)); Magazzino II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey)). Preparare soluzioni di coloranti fluorescenti. Per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti, memorizziamo 30 aliquote da ml di entrambi i coloranti a -20 ° C, sufficiente per un esperimento: Voltaggio-sensibile colorante RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) soluzione madre, 1,25 mg / ml soluzione in dimetilsolfossido (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); Calcio indicatore Rhod-02:00 (Invitrogen, Carlsbad, CA) soluzione madre, 1 mg / mL di soluzione in DMSO. Preparare eccitazione-contrazione blebbistatin soluzione disaccoppiatore magazzino (Bioscience Tocris, St. Louis, MO, 2 mg / mL di soluzione in DMSO) in anticipo e conservare il blebbistatin sciolto a 4 ° C. 2. Preparare le soluzioni di perfusione e sperimentale 7 Appena preparare la soluzione di Tyrode 2L (128.2mM NaCl, 1.3mm CaCl 2 (2H 2 O), 4,7 mm KCl, 1,05 mm MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 11.1mM D-glucosio in acqua deionizzata, pH = 7,35 ± 0,05). Se la soluzione viene attualmente usato per fare 2L di soluzione di Tyrode (sufficiente per un esperimento) prendere 1750 ml di acqua deionizzata e mescolare in 125 ml di Stock I, 125 ml di Stock II e 4g di glucosio. Accendere i due pompe dei sistemi di perfusione. Impostare la pompa peristaltica (Peri-Star, WPI, Sarasota, Stati Uniti) che viene utilizzato per la perfusione retrograda a 40 ml / min. Impostare l'altra pompa peristaltica (Cole-Parmer Masterflex Pompa Peristalic L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) che viene utilizzato per superfusione e di restituire il perfusato al serbatoio tenendo a 80 ml / min. Lavare il sistema di perfusione con etanolo al 70% per 30 min e poi con 2 litri di acqua deionizzata. Una volta che tutta l'acqua deionizzata è evacuata dalla camera, far circolare la soluzione del Tyrode e passare attraverso un filtro a 5 micron (Millipore, Billerica, MA, USA). Scaldare il perfusato a +37 ° C con una camicia d'acqua e circolatore (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) e ossigenare il perfusato facendo gorgogliare O 2 / CO 2 (95% / 5%) del gas nella soluzione. Monitorare il pH della soluzione con un pH-metro (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) e regolare la velocità di O 2 / CO 2 bolle di mantenere il pH a 7,35 ± 0,05. Continua il monitoraggio del pH e temperatura durante l'esperimento. L'apparecchio a doppia mappatura ottico è costituito da due MICAM Ultima-L telecamere CMOS (SciMedia, Costa Mesa, CA) che hanno un alto spaziale (100×100 pixel, 230 ± 20 micron per pixel) e temporale (1.000-3.000 fotogrammi / sec) risoluzione. Fissare un filtro passa-banda (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, New Jersey) davanti alla telecamera calcio designato immagini, mentre, un filtro passa-lungo (> 700 nm, Thorlabs, Newton, New Jersey) deve essere posizionato in davanti alla telecamera tensione designato imaging. Le telecamere sono disposti perpendicolarmente l'uno all'altro da titolare, che contiene uno specchio dicroico (635 nm di taglio, Omega Optical, Brattleboro, VT). Immediatamente sotto il supporto dual camera c'è un obiettivo (Nikon NIKKOR 55 millimetri 1:1,4 235052), che focalizza la luce di emissione che viene dal cuore sullo specchio dicroico. La distanza di lavoro è di circa 3cm. La luce di eccitazione è generata da una lampada alogena (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) ed è passato attraverso un filtro di calore, otturatore e filtro passa-banda (520 ± 45 nm). La guida di luce flessibile dirige il passa-banda luce filtrata sulla preparazione, e un otturatore è usato per garantire che la preparazione è esposto alla luce solo durante l'acquisizione di immagini al fine di evitare photobleaching dei coloranti. Preparare Ag / AgCl 2 elettrodi per la stimolazione e sensing in anticipo e installarli nella camera prima di mettere il cuore. Assicurarsi che gli amplificatori e filtri vengono regolate a livelli adeguati. 3. Raccolto il cuore del mouse, cannulate, e impostare la perfusione Langendorff Anestetizzare il mouse con ketamina / xylazina (ketamin, 80mg/kg di peso corporeo; xylazina, 10 mg / kg di peso corporeo) ed eparina (100 unità) mediante iniezione intraperitoneale. Assicurare un adeguato livello di anestesia dalla mancanza di riflesso il dolore. Dopo una metà sternale incisione, rimuovere velocemente il cuore e lavarlo in ossigenata (95% O 2, 5% CO 2), a temperatura costante (37 ± 1 ° C) Tyrode la soluzione. Utilizzando un microscopio da dissezione, Identificare rapidamente l'aorta e fare un taglio netto tra l'aorta ascendente sotto l'arteria succlavia destra. Un breve tratto di aorta viene poi attaccato ad una misura da 21 gauge cannula con una punta svasata. 4-0 nero-sutura di seta intrecciata (Surgical Corporation Specialità, Reading, PA) viene utilizzata per fissare il cuore sulla cannula. Dopo incannulazione, il cuore è retrogrado e superfused perfuso con la soluzione di Tyrode. Il tasso di perfusione retrograda viene regolato nel range di 2-5 mL / min per mantenere la pressione aortica tra i 60 e 80 mmHg (trasduttore di pressione, World strumenti di precisione Inc (WPI), Sarasota, Stati Uniti d'America; Ponte Amplificatore TBM4M, WPI, Sarasota, USA). Dopo che il cuore è cannulata, polmone, timo, e tessuto adiposo vengono poi sezionati e rimossi. Il cuore isolato è appuntato (Strumenti di scienze arti) al vertice al fondo della camera di perfusione (patinata Sylgard) per evitare flusso indotta movimento. Le appendici atriale destra e sinistra sono anche allungati e appuntato (Strumenti Scienza Fine, Inc, Foster City, CA) al fondo della camera, che offre massima area di superficie per misurazioni ottiche degli atri. Molto importante! Un tubo di silicone viene inserita nel ventricolo sinistro attraverso le vene polmonari e fissato dalla sutura di seta al vicino tessuto connettivo. Questa soluzione evita la congestione e l'acidificazione del perfusato intrappolati nel ventricolo sinistro, che è particolarmente importante dopo la soppressione delle contrazioni del ventricolo con una eccitazione-contrazione disaccoppiatore (vedi parte 4 punto 19). Un elettrodo di misura è posto sulla superficie del cuore di condurre la stimolazione stimoli, che viene generato dal Maestro-8 (AMP Instruments Ltd, Gerusalemme, Israele) o PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australia). Un bicchiere piccolo coperchio è fissato sulla superficie della soluzione sul cuore per ridurre artefatti da movimento dalla soluzione vibrante. Focalizzare la luce di eccitazione sul cuore. Inoltre, regolare la distanza tra l'apparato doppia fotocamera e il cuore in modo che la risoluzione massima si ottiene. Spegnere tutte le luci in sala e cominciare le registrazioni elettrica usando PowerLab 26T. 4. Tensione a vuoto e tinture di calcio sensibili e eccitazione-contrazione disaccoppiatore Warm-up 0.6 ml di blebbistatin. Mescolare 0,5 ml di blebbistatin con il perfusato nel serbatoio azienda. Diluire il restante 0,1 mL di blebbistatin in 1 ml di soluzione Tyrode e iniettare lentamente (in un periodo di 20 minuti) attraverso una porta di droga vicino alla cannula. Osservare come blebbistatin riduce gradualmente la artefatti da movimento. Diluire 30 ml di tensione sensibili colorante RH237 soluzione madre in soluzione 1 ml Tyrode e iniettare lentamente oltre 5-7 minuti nella porta di iniezione stesso blebbistatin. 30 microlitri di calcio indicatore Rhod-2 1:01 AM è mescolato con Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% soluzione in DMSO) e poi diluito in 1 mL di soluzione Tyrode e lentamente applicato su 5-10 min attraverso la porta stessa iniezione . Attendere 5-10 minuti per blebbistatin e tinture per raggiungere la membrana cellulare e citosol. Continuare con il protocollo quando il movimento è completamente soppresso. Monitorare costantemente le registrazioni ECG sopra l'intera procedura per garantire la normale funzione elettrica del cuore. Iniziare le registrazioni del segnale fluorescente SciMedia utilizzando il software personalizzato (SciMedia, Costa Mesa, CA). 5. Rappresentante dei risultati: Figura 1. Impostazione sperimentale per la perfusione, registrazioni elettrici e la mappatura ottica. EM = emissioni; Lp = longpass Figura 2. Preparazione sperimentale ed esempi segnale registrato durante la stimolazione ventricolare. A sinistra: segnali ECG sono raccolti direttamente presso Ag / AgCl 2 elettrodi disco (in alto) e un esempio di S1S1 protocollo di stimolazione è mostrato (in basso). Centro: preparazione del mouse Langendorff cuore. A destra: Rappresentante potenziali d'azione ottica e segnali di calcio transitori da atri (Top) e ventricoli (basso) sono mostrati. La freccia gialla (Top) punti alla dispersione segnale fluorescente proveniente dal ventricoli, che si vede nelle registrazioni atriale. LV = ventricolo sinistro; RV = ventricolo destro; LA = atrio sinistro; RA = atrio destro Figura 3. Rappresentante registrazioni ottiche di V m e Cat dai ventricoli di un cuore selvaggio del mouse tipo. A. La preparazione sperimentale con una serie di punti equidistanti segnata da punti neri il cui ottica registrazioni può essere visto in (C). B. Esempio di tracciamento V m ed il gatto da una posizione centrale sulla matrice (vedi box in (C)). C. V m (blu) e CAT (rosso) dalla serie di punti equidistanti. Segnali sono stati cestinate 3×3. Figura 4. Mappa di attivazione e conduzione. R. Un esempio di attivazione mappa di un cuore selvaggio del mouse di tipo trasversale con (T) e longitudinale (L) le direzioni indicate dalle frecce bianche. B. V segnali m (in alto) e dV / dt (basso) corrispondenti ai tre punti di vista in A (T1, T2, T3, L1, L2, L3). Figura 5. Potenziale d'azione e l'analisi della durata di calcio transitori. Durata del potenziale d'azione A. ripolarizzazione a 80% (APD80) e la durata transitoria calcio a 80% relax (CAD80) le mappe sono indicate da un cuore in condizioni di controllo (sinistra) e dopo 30 applicazioni nM isoproterenolo (Destra). Il colore giallo / verde nei ventricoli (a destra) indica isoproterenolo accorciato APD80 e CAD80. B. Esempio di tracciati APD80 e CAD80 dai ventricoli del mouse di tipo selvatico (Top) e atri (in basso).