Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato
Summary
Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.
Abstract
O estabelecimento de uma rede funcional dos vasos sanguíneos é uma parte essencial da organogênese, e é necessário para a função do órgão ideal. Por exemplo, na formação adequada vascularização do timo e padronização é essencial para a entrada timócito no órgão e saída de células T maduras para a periferia. O arranjo espacial dos vasos sanguíneos no timo é dependente de sinais a partir do microambiente local, ou seja, células epiteliais tímicas (TEC). Vários relatórios recentes sugerem que a interrupção desses resultados no timo sinais de sangue 1,2 defeitos navio. Estudos anteriores descreveram técnicas usadas para rotular os 1,2 vasculatura neonatal e adulto timo. Nós demonstramos aqui uma técnica para a rotulagem dos vasos sanguíneos no timo embrionárias. Este método combina o uso de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectina I (GSL 1 – isolectin B 4) injeções veia facial e coloração de anticorpos CD31 para identificar timo estruturas vasculares e PDGFR-β para rotular tímica perivascular mesênquima 3-5. A opção de usar ou seções criosecções vibratome também é fornecido. Este protocolo pode ser usado para identificar defeitos do timo vascular, que é crítico para a definição dos papéis dos TEC derivadas moléculas na formação do timo dos vasos sanguíneos. Como o método de rótulos toda a vasculatura, ele também pode ser usado para analisar as redes vascular em vários órgãos e tecidos em todo o embrião, incluindo pele e do coração 60-10.
Protocol
Discussion
Todo o monte e PECAM-1 (CD31) coloração em cortes são os métodos convencionais para a rotulagem da vasculatura embrionárias em camundongos. Estes métodos requerem o uso de imunofluorescência direta e / ou indireta, e detergentes para permeabilizar o tecido mouse. Isso prova a ser um processo bastante oportuna. Aqui, nós empregamos FITC-dextran ou isolectin B 4 injeções veia facial diretamente rótulo a vasculatura embrionárias, eliminando a exigência de rotulagem passos de anticorpos. Além disso,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por números conceder R01AI055001 e R01AI082127 de NIAID a NRM e Award Fellowship SREB Dissertação de JLB.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| FITC-dextran | Sigma | FD150S-1G |
| Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 |
| PFA | Fluka | 76240 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR | 25608-930 |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 |
| rat anti-mouse CD31, | BD Pharmingen | 558736 |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 |
| Benzyl Alcohol | Acros Scientific | 148390010 |
| Benzyl Benzoate | Acros Scientific | 105860010 |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Scientific | 152222 |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F |
| Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| 4mL clear vials | National Scientific | B7800-2 |
Riferimenti
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
