Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno
Summary
Este método permite la caracterización de bacterias extendido co-cultivo con EpiAirways, principal tejido humano respiratorias epiteliales cultivadas en la interfase aire-líquido, un biológicamente relevantes<em> In vitro</em> Modelo. El enfoque se puede utilizar con cualquier microbio que puede ser objeto de cooperación a largo plazo de la cultura.
Abstract
Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) están adaptados a los humanos bacterias Gram-negativas que pueden causar infecciones recurrentes y crónicas de la mucosa respiratoria 1, 2. Para estudiar los mecanismos por los cuales estos organismos sobreviven en el interior de los tejidos y las vías respiratorias, un modelo en el que puede tener éxito a largo plazo co-cultivo de bacterias y células humanas llevadas a cabo es necesario. Usamos primaria tejidos humanos epitelio respiratorio elevado a la interfase aire-líquido, el modelo EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Estos no son inmortalizados, bien diferenciados, en 3 dimensiones los tejidos que contienen uniones estrechas, las células ciliadas y no ciliadas, células caliciformes que producen mucina, y retener la capacidad de producir citocinas en respuesta a la infección.
Este biológicamente relevantes en el modelo in vitro de la vía aérea superior humano puede ser utilizado en un número de maneras, el objetivo general de este método es llevar a cabo a largo plazo co-cultivo de tejidos EpiAirway con NTHi y cuantificar células asociadas a bacterias e internalizada a través del tiempo . Además, la producción de mucina y el perfil de citoquinas de las personas infectadas co-cultivos se puede determinar. Este enfoque mejora en los métodos existentes de que los protocolos actuales que utilizan muchos sumergidos monocapa o Transwell cultivos de células humanas, que no son capaces de soportar las infecciones bacterianas durante períodos prolongados 3. Por ejemplo, si un organismo se puede replicar en los medios de comunicación por encima, esto puede resultar en niveles inaceptables de la citotoxicidad y la pérdida de las células huésped, deteniendo el experimento. El modelo EpiAirway permite la caracterización de largo plazo huésped-patógeno interacciones. Además, dado que la fuente de la EpiAirway es humano normal traqueo-bronquial células en lugar de una línea inmortalizada, cada uno es una excelente representación de la actual tejido humano del tracto respiratorio superior, tanto en estructura como en función de cuatro.
Para este método, los tejidos EpiAirway son destetados de compuestos anti-microbianos y anti-hongos durante 2 días antes de la entrega, y todos los procedimientos se realizan bajo condiciones libres de antibióticos. Esto requiere consideraciones especiales, ya que tanto las bacterias y los principales tejidos humanos se utilizan en la misma cabina de bioseguridad, y son co-cultivadas por períodos prolongados.
Protocol
Discussion
Este método permite la investigación a largo plazo de las interacciones huésped-patógeno en un fondo biológicamente relevantes de primaria tejidos humanos respiratorias en la interfase aire-líquido. Aquí hemos utilizado HiNT como el organismo de la infección, pero la interacción de cualquier bacteria que no presenta citotoxicidad inaceptable con el tiempo se puede cuantificar con este método. El modelo EpiAirway también puede ser utilizado para el estudio de los virus, las drogas o productos químicos que afe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Patrick Hayden (MatTek) útil para los debates, y Robert Smith y Perry Libby de Georgia Ciencias de la Salud de la Universidad por sus habilidades EM. Este estudio fue financiado por NIDCD conceder DC010187 de DAD
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
Riferimenti
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
