تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور
Summary
وقد أصبح البروتين تصور عينات بواسطة المجهر الإلكتروني السلبية وصمة عار (EM) شعبية طريقة التحليل البنيوي. ومن المفيد للتحليل الكمي الهيكلية ، مثل احتساب إعادة الإعمار 3D من الجزيئات التي تجري دراستها ، وكذلك لفحص النوعية نوعية التحضيرات البروتين. في هذه المقالة نقدم بروتوكولات تفصيلية لإعداد شبكات EM ، تلوين العينة وتصور العينة في المجهر الالكتروني. يمكن للمستخدمين المبتدئين اتبع بروتوكولات بسهولة وصمة عار على الاستفادة السلبية EM باعتباره فحص روتيني ، بالإضافة إلى فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى ، لتقييم عينات من البروتين.
Abstract
أصبحت واحدة المجهر الإلكتروني الجسيمات (EM) ، على حد سواء سلبية أو المجمدة ملطخة العينات البيولوجية المائية ، وهو أداة متعددة الاستعمالات في مجال البيولوجيا البنيوية 1. في السنوات الأخيرة ، وحقق هذا الأسلوب نجاحا كبيرا في دراسة هياكل من البروتينات والجزيئات المجمعات 2 ، 3. مقارنة مع الإلكترون cryomicroscopy (cryoEM) ، التي هي جزء لا يتجزأ في العينات المجمدة البروتين المائية في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي 4 ، تلطيخ السلبية هو إعداد نموذج أبسط الطريقة التي هي جزء لا يتجزأ من البروتين في عينات من طبقة رقيقة من الملح المجفف لزيادة المعادن الثقيلة تباين العينة 5. في المقابل تعزيز صمة سلبية EM يسمح فحص العينات البيولوجية الصغيرة نسبيا. بالإضافة إلى تحديد ثلاثية الأبعاد (3D) بنية تنقية البروتينات أو المجمعات 6 البروتين ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لأغراض أوسع من ذلك بكثير. على سبيل المثال ، وصمة عار سلبية يمكن استخدامها بسهولة EM لتصور المنقىعينات من البروتين ، والحصول على معلومات مثل التجانس / تجانس العينة ، وتشكيل المجمعات البروتين أو التجمعات الكبيرة ، أو ببساطة لتقييم جودة إعداد البروتين.
في هذه المقالة الفيديو ، نقدم بروتوكول كامل لاستخدام EM لمراقبة ملطخة سلبا على عينة من البروتين ، من إعداد شبكات الكربون المغلفة وصمة عار على EM السلبية لاكتساب صورة لنموذج ملون سلبا في مجهر الكتروني يعمل على تسريع 120kV الجهد. وقد استخدمت هذه البروتوكولات في مختبرنا عادة ويمكن اتباعها بسهولة من قبل المستخدمين المبتدئين.
Protocol
Discussion
ملون سلبي EM هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لدراسة هياكل 3D عينات البروتين المنقى ، مثل استخدام الميل المخروطية عشوائي 8 الأسلوب ، الأمر الذي يتطلب جمع زوج من الصور مع واحدة من العينة يميل إلى 60 درجة واحد من نفس المنطقة لكن untilted ، لحساب إعادة بناء المجمعات 3D الجزيئات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تلطيخ السلبية EM والعديد من التطبيقات الأخرى ، مثل الكشف عن بلورات (2D) ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء 9 ، تصور مجمعات البروتين في التشكل مختلفة 10 ، أو لمجرد تصور التجانس و / أو عدم تجانس تنقية البروتينات عينة هكذا توفير التغذية المرتدة لتحسين إجراءات تنقية البروتين ، وما يمكن أن يكون قويا لفحص الكيمياء الحيوية. في هذه المقالة ، قدمنا البروتوكولات بدءا من إعداد شبكات الكربون المغلفة لجمع عينات من الصور الملطخة سلبا البروتين في المجهر الالكتروني. كما هو موضح هنا ،هذا الإجراء هو بسيط وسهل وليس لاحقا. إذا محاولة حساب 3D اعادة البناء من العينة العشوائية التي يرصدها أسلوب الميل المخروطية ، فمن الضروري الحصول على صور الزوج الميل. ومع ذلك ، إذا كان أداء واحدة تحليل الجسيمات هو الغرض ، وصور متعددة untilted تكفي. في كلتا الحالتين ، مطلوب مزيد من معالجة الصور ، وهذا هو خارج نطاق هذه المقالة الفيديو.
كما هو الحال مع أي أسلوب ، هناك اختلافات في البروتوكولات. فورمات اليورانيل يعمل بشكل جيد جدا وكاشف وصمة سلبية في معظم الحالات. خلات اليورانيل آخر استخداما كاشف صمة سلبية. يعمل مشابهة جدا لفورمات اليورانيل ، ولكن مع حجم أكبر من الحبوب ، وفي كثير من الحالات ، وانخفاض النقيض من فورمات اليورانيل. وميزة استخدام خلات اليورانيل هو أن يستمر لفترة أطول من الحل فورمات اليورانيل. لا يحتاج المرء أن يعد حلا جديد كل أسبوع واحد أو اثنين. كلا فورمات اليورانيل وخلات حمضية. مصدر قلق واضح هو أنيمكن أن تحدث تغييرات انخفاض الرقم الهيدروجيني في العينة البروتين التي تجري دراستها. وصمة عار على كل من حلول وظيفة أيضا مثبتات البروتين. وقد أظهرت دراسة سابقة أن كلا من عينات البروتين 7 الإصلاح بسرعة. هذا التثبيت السريع يجعل انخفاض الرقم الهيدروجيني أقل أهمية. أثناء عملية التلوين ، وشمل عينة من البروتين تصبح ثابتة قبل انخفاض الرقم الهيدروجيني يمكن أن تحدث أي تغييرات. ومع ذلك ، قد الكواشف الأخرى صمة سلبية ، مثل موليبدات الأمونيوم وحمض الفسفوتنغستيك ، تحقق نتائج أفضل لتلطيخ عينات عند انخفاض الرقم الهيدروجيني هو مصدر قلق 7. كلا موليبدات الأمونيوم وحمض الفسفوتنغستيك لديها درجة الحموضة محايد تقريبا ، ولكن على النقيض من عينات البروتين التي تولدها هذه البقع عادة ما تكون أقل شأنا من فورمات اليورانيل.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الإلكترون المجهري العمل في المختبر تشنغ هو الدعم جزئيا عن طريق المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (1R01GM082893 ، 1R01GM098672 ، 1S10RR026814 – 01 وP50GM082250 (ألف لفرانكل)) ، ومنحة من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية الاختراق ، وجائزة الفرص وجائزة التكنولوجيا الجديدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella Inc., USA | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella Inc., USA | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella Inc., USA | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella Inc., USA | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
Riferimenti
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
