Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

1. 내피 전구 세포의 분리 이전 EPC 번시드인 튜브 주입으로 30 일이 항응고제 구연 산염의 덱스 트로 오스 솔루션의 15 ML과 60 ML의 주사기를 준비하고 주변 돼지 혈액에서 EPC 고립을위한 3 방향 정류장 꼬추 보안. 24 이전에 혈액 추첨, precoat 1 형 콜라겐의 쥐 (50 μg / ML, 0.02 N 아세트산 용액에 용해) 4 두 12 잘 접시에 시간. 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라 오직 감독 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인 이후에 모든 동물의 치료 및 시험을 실시합니다. 진정 여성 요크셔 Acepromazine와 돼지 (45kg) (1.1 밀리그램 / kg)와 케타민을 (22 MG / kg) 19 G 나비 바늘을 통해 근육. endotracheal 튜브 (30cm 길이, 8mm의 ID)와 돼지를 Intubate하고 (마스크에 의해 갯벌 볼륨의 4.5 %) Isoflurane과 돼지를 마취. 산소 포화도, 심장 박동수와 온도를 측정하여 절차를 수행하는 동안 돼지를 모니터링합니다. 자동 온수 운영 테이블과 난방 담요를 사용하여 주입하고 체액을 온난하여 thermoregulation를 유지합니다. 운영 테이블에 위로 향한 위치에 돼지를 놓고, caudolaterally 뒷다리 팔다리를 확보하고, DuraPrep 살균 다음 Chlorhexidine로 닦아주십시오. 다음 골반 영역을 draping로 진행합니다. 대퇴 정맥에 만져서 알 수있는 대퇴 펄스 (vastus medialis에 중간과 그레이 실리스 근육으로 가로) 단 중간 5 F 마이크로 introducer 키트에서 21 G X 7cm 바늘을 삽입하고 Seldinger 기술을 사용하여 정맥을 cannulate. intravascular 카테터에 대한 준비 60 ML의 주사기를 연결하고 혈액의 45 ML을 그립니다. hemostasis (5 분)을 달성하기 위해 선박 찔린 사이트에 압력을 기다려, 마취를 중단하고 돼지를 복구합니다. 동물은 전체 복구까지 모니터링 및 케이지로 반환됩니다. 혈액 솔루션 행크의 버퍼 소금 솔루션 1시 1분 (CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 않고)과 잘 정의된 레이어를 만들 수 Histopaque 동등한 볼륨의 레이어를 희석. 원심 분리기 (30 분, 740g, 낮은 휴식 설정) 및 수집 mononuclear 세포 (MNC) 계층. Resuspend과 Dulbecco의 인산과 함께 씻어 MNCs X 3 전체 성장 매체에 두 12 잘 접시 (EBM – 2 중간 2% 돼지의 혈청 (PS)과 EGM – 2로 도금하기 전에 살린 (DPBS)을 (10 분, 515g) 버퍼 37 SingleQuots)는 ° C, 5 % CO 2. 천천히 다음 첫 번째 7 일간, 매일 다른 하루를 24 시간마다 중간 변경할 수 있습니다. 평균 시간 이후 EPC 식민지를 식별 7 일 (그림 2). 그들은 12 잘 면적의 ¼을 커버 한 문화에 EPCs를 확장합니다. 표면 마커의 CD14 CD31과 부재, CD45의 존재에 대해 테스트하여 유동세포계측법와 EPC 신원을 확인합니다. 수행할 수 있습니다 기타 assays 4 흐름에 노출 후 세포 형태학 및 질산 산화물 III 활동을 포함합니다. 2. 티타늄 튜브 어셈블리 HHS는 슬리팅 72 이빨 3 같은 120도 단위 (4.5 cm 길이)에 길이 방향 섹션 티 튜브는 수직 밀링 머신에서 본 아버에 의해 장소에서 개최 보았다. 300 RPM에서 그것을 실행하고 절단하는 동안 항상 탭 매직 절삭 유체 (그림 3)과 포화 절삭 영역을 유지. 탁상 그라인더와 스카치 – 브라이트 금속 가공 휠과 안쪽 표면을 폴란드어. 그렇다면 더욱 부드러운 표면에 3M 에머리 천으로 수동 폴란드어는 보이는 구덩이를 제거합니다. 왕수 높은 부식성이며 물을 10 몇 리터와 rinsing 다음 왕수 (집중 염산에 1시 3분 농축 질산). 운동 극단주의에 잠수 5 분 뒤에 Alconox 비누 솔루션 티의 조각을 청소 잠재적으로 폭발! Sonicate 티 섹션은 Alconox 비누 용액에 X 16 분, 탈이온수에서 X 30 상승하고 다시 탈이온수에서 X 16 분 sonicate. 층류 후드의 건조하도록 허용합니다. 4.5 cm의 길이와 2.4 당 철저하게 청소 절단 PVC 열 수축 튜브. 지원 심봉 (알루미늄, 8.5 mm OD에서 기계 가공)와 티 섹션 주변 PVC 열 수축 튜브 (그림 4)의 장소 소매에 3 청소 티 섹션을 배치 핀셋을 사용합니다. 고르게 단단히 함께 티 섹션을 포장 심봉 선회하는 동안 열 총을 튜빙을 축소. 3. 심는 장치와 부품 조립 2.5 cm 및 3.5 cm의 길이로 실리콘 튜브 컷. 제 5 CC 플라스틱 0.8 ML 마크에서 주사기와 luer 종료와 함께 '머리 기사'를 유지. 철저하게이 X의 실리콘 섹션, 주사기 '머리 기사'와 같은 2.4 이하 설명 sonication하여 luer 모자를 청소하십시오. 엑스턴, 2.5에서 조립 티 튜브의 각 끝에 실리콘 튜브 추가PVC 관을 통해 5mm로 딩. 그것이 티 튜브 (그림 5)와 맞닿아 있도록, 짧은 실리콘 튜브에 주사 '머리 기사'의 끝을 잘라 넣습니다. 시일이 Tyvek 파우치 및 산화 에틸렌 (55에서 18시간 ° C)와 함께 가스 소독 한 luer 모자와 티 튜브 어셈블리를 완료했다. 플렉시 글라스 플랫폼에 동기 타이밍 모터 (10 피) 마운트와 주사기 홀더 (알루미늄에서 가공, 5 CC의 주사기에 맞는) (그림 6)의 차축을 연결합니다. 4. 티 튜브 내부 표면의 EPC – 시딩 1 아래에 고립으로 EPCs를 확장합니다. T – 75 flasks 3 합류 (또는 적어도 9 X 10 6 세포)에 적용됩니다. 수술 당일, 장기 염료 (PKH26) 11 찬란 라벨 세포. 혈청 무료로 중간에 두번 교양 EPCs을 rinsing하여 시작합니다. 레이블 중 후 세포를 보호하기 위해 조명 노출을 제한하는주의. 4 분간 실온에서 희석제 C 4 μm의 PKH26 (염료 솔루션)와 세포를 커버. 솔루션을 염색과 동일 볼륨에서 돼지의 혈청을 추가하여 반응을 레이블링 중지합니다. 한 분 이상, 전체 성장 매체와 결합된 솔루션 1시 1분을 희석. 액체를 대기음 및 전체 성장 매체와 세포 X 3 린스. (CaCl 2, MgCl 2 제외) 회 DPBS에서 EPCs 씻으십시오. 3 분 37 트립신과 부화에 세포 ° C를 커버하고 가벼운 현미경으로 부대를 확인합니다. 사용 트립신의 더블 볼륨에서 트립신의 중화 솔루션을 추가합니다. pipetting하여 단일 튜브와 믹스로 세포 솔루션을 결합합니다. 계산을위한 hemocytometer의 각 측면에 세포 용액 10 μl를 추가합니다. 원심 분리기 세포 솔루션 (1500 피, 5 분).. 2 셀 및 resuspend 펠렛 카운트 – 2.5 X 10 6 EPCs / ML를 혈청 자유로운 매체 인치 튜브 조립 4.5 ML입니다 채우기 위해 최소한의 볼륨을합니다. 무균 필드 생물 학적 모자 살균 수건을 놓는다. 오픈 멸균 분야에 티 튜브 어셈블리 및 추가 5 CC 주사기 가스 소독. 멸균 장갑, 5 CC의 주사기에서 플런저를 제거하고 나중에 사용하기 위해 필드에 계속. 이 주사기에 접사 luer 모자. Pipet 4.5 – 오픈 주사기 배럴로 4.9 이하 5 ML EPC 서스펜션. 안전하게 다시 주사기의 열린 끝을로 플런저를 넣습니다. 위쪽 뚜껑과 주사기를 잡고 뚜껑을 제거합니다. 티 튜브 내에서 진행하지 않는다 아늑한 때까지 티 튜브 어셈블리의 오픈 실리콘 튜브로 첫째 luer 엔드와 주사기를 삽입합니다. 사전 주사기 플런저 천천히 세포 솔루션은 시스템에서 거품을 제거하는 '머리 기사'컷 주사기 상단에 도달할 때까지. luer 모자와 닫고 테이프로 열린 끝을 밀봉, 살균 칼집에 온 회중를 삽입합니다. 3.7 가공 주사기 홀더에이 전체 어셈블리를 넣습니다. 37 인큐베이터에 넣어 ° C와 시딩 챔버의 티 튜브 부분은 수위 게이지 (그림 6)를 사용하여, 수준되도록 플랫폼을 조정합니다. 티 튜브 조립이 주입 30 분 전에 회전을 허용합니다. 5. 돼지의 하부 대정 맥에 티 튜브 주입 이전 수술로 24 시간 정도, 펜타 닐 패치 (; 장소 X 72 시간 이내에 패치를 유지 100 μg / transdermal HR)와 돼지 (EPCs가 고립되었던에서) premedicate. 돼지 NPO를 밤새 유지하고 수술 당일 (5 MG / kg, IM)에서, 항생 예방으로 24 시간마다, 다음 7 일 동안 preoperatively Baytril (Enrofloxacin)을 관리할 수 있습니다. 진정, intubate 및 1.3 아래 설명된대로 돼지를 마취 (10 -15 ML / kg의 갯벌 볼륨)과 수술실 테이블에 위로 향한 위치에 돼지를 확보. 산소 포화도, 심장 박동수와 온도를 측정하여 절차를 수행하는 동안 돼지를 모니터링합니다. 자동 온수 운영 테이블과 난방 담요를 사용하여 주입하고 체액을 온난하여 thermoregulation를 유지합니다. 돼지의 귀 정맥에 18 G IV 카테터를 삽입하고 Vetropolycin의 안약과 돼지의 눈을 보호합니다. 청소, 준비 및 1.6에서와 같이 돼지의 복부를 내리면 t. caudally 설정 마지막으로 cranially 2에 내유 땀샘의 2 세트에서 # 15 메스 블레이드와 정중선을 절개. electrocautery와 복부 근막에 절개를 아래로 운반. 모스키토 포셉로 복막을 들어, 조심스럽게 Metzenbaum 가위로 입력합니다. 방광을 외면 화하다하고 방광 벽에 ​​3 – O Vicryl 지갑 – 문자열 치료를 놓습니다. 그 중간에 자상 절개를 놓고 16 F 폴리 카테터를 삽입합니다. 에 소변 출력을 적정하다하는 정맥 체액을 (락트 링거스) 관리> / = 1 ML / 수술 중에 ㎏ / HR. 다음, 크고 작은 창자과 장소 복막 구멍의 후부 측면을 노출하고 하부 대정 맥 (IVC)을 식별하는 방법은 두 발포어 외과 견인기을 외면 화하다. 신중하게, 샤프하고 무딘 절개를 사용하여 조직을 둘러싼에서 IVC을 무료로 말초 IVC의 분기점에 근위 오른쪽 신장 동맥에서 혈관을 해골로 만들다. IVC에도 아주 작은 결함이 동물의 급속한 출혈과 과다로 이어질 수 있으므로 IVC의 절개하는 동안 극도의주의 운동. 이식하는 티 튜브 주위에 출혈은 없을 것입니다 않도록 IVC 세그먼트의 모든 측면 지점을 Ligate. 매우 신중 해부와 결합을 필요로 일반적으로 대형이 후부 요추 정맥을 확인합니다. 또한, IVC의 분기점 즉시 근위, 대형 요추 정맥은 일반적으로 posteromedial 측면에서 발생하고 있으며 무료 클램프 배치 준비에 들어왔습니다 루프로 제어를 해부해야합니다. 티 튜브 동시에 같은 네 아래의 설명을 심는 진행합니다. 바로 전에 IVC를 클램핑 100 USP / 헤파린의 kg을 관리할 수 있습니다. distally IVC와 요추 정맥에 45도 각도 외과 클램프를 삽입하고 proximally. 포츠 가위로 확장하여 다음 11 # 메스 블레이드를 사용하여 근위 및 말초 클램프 사이의 길이 veinotomy (4cm)을 만듭니다. IVC로부터 혈액을 벗어나 살균 DPBS와의 내부 루멘을 내리. 이제 IVC에 EPC 번시드인 티 튜브 (또는 노출된 금속 제어) 삽입 및 건조로부터 세포를 방지하고 공기를 피난 DPBS (CaCl 2, MgCl 2)로 채우십시오. 4-0 Prolene 실행 봉합과 veinotomy를 닫고 다시 피의 소량을 통해 드 공기 IVC 한 근위 클램프를 제거합니다. 시간이 지남에 따라 보형물의 마이 그 레이션을 방지하기 위해 PVC 관으로 정맥 벽을 통해 '숙박 – 봉합'을 넣으십시오. 2 – O Vicryl (봉합을 실행)와 중부 표준시의 바늘과 피하 공간에서 O – PDS와 근막을 닫습니다. 스테이 플스와 함께 피부를 닫습니다. 절개 사이트 subcutaneously 따라 0.25 %의 Marcaine (Bupivacaine) 20 ML까지 관리하고 거즈와 Tegaderm과 상처를 커버. subcutaneously으로 고통에 필요한을 – 또한 Flunixin (2.2 밀리그램 / kg Q 24 시간)과 Oxymorphone에게 (4 시간 0.15 밀리그램 / kg Q 3) 제공합니다. 마취를 중단, 깨어 때까지 돼지를 모니터링하고 케이지로 돌아갑니다. 조난 / 고통 서와 ambulation, 대변 및 소변 출력, 그리고 정상적인 재관류를 나타내는 피부 색깔의 징후 회 돼지를 모니터링합니다. 6. 티 튜브 Explantation 삼주 후, 진정, intubate과 같은 1.3에 설명되어있는 돼지 마취 – 1.4. 5.8 -로 5.5에서 설명된 개복술과 함께 진행합니다. 흉터하면 임플란트 사이트를 감추다됩니다하지만 현장에서 가장 까다로운 티 튜브를 만져보다 수 있습니다. 로 5.9에 설명되어있는 IVC 밖으로 해부하다 – 5.11과 티 튜브 무거운 가위로 주변 IVC와 엉 – 블록 explant. Euthasol의 안락사 솔루션 (390 MG / ML Pentobarbital 나트륨과 1 ML / 10파운드 50 MG / ML Phenytoin 나트륨)와 동물을 안락사. 7. 고정 및 이미징 티 내부 표면 DPBS 솔루션에 티 튜브와 excised 정맥 세그먼트를 씻어 고해상도 디지털 카메라 (그림 7)와의 루멘 (특허 또는 occluded)를 사진. 다음 15 분 최소 3.7 %의 paraformaldehyde에 잠수하여 표본을 수정. DPBS 솔루션 표본을 씻어. 아주 조심스럽게 주위의 정맥과 티 튜브를 열 PVC 관을 절개. 레드 / 오렌지 색상 (그림 8A)에 PKH26 – 표시 EPCs을 시각화하기 위해 550 나노미터 여기 파장에 따라 목표 / 광원과 이미지를 직면하고있는 내부 표면과 형광 현미경으로 3 섹션을 배치합니다. 원하는 경우, 전지 (예 : 혈소판 내피 세포 접착 마커 (PECAM 셀 테두리 (그림 8B), 핵을 시각화하기 위해 DAPI – 얼룩 등 시각화하는) 얼룩) 추가로 물들일 수있다. 8. 대표 결과 : 이 프로토콜의 실행에 따라, 의사와 과학자들은 대형 동물 모델에서 autologous 혈액 유래 내피 전구 세포와 고체 튜브 구조를 endothelialize 수 있습니다. 그림 2 보여줍니다 우리의 방법으로 격리 EPCs가 약 7 일 후에 코블스톤 형태로 식민지 보인다 문화. 그림 5와 그림 6에서 우리 시딩 장치는 살균 조건 9 아래 튜브의 내부 표면의 균일한 커버 리지에있는 EPC 현탁액 및 결과 가득한 티 튜브의 느린 회전 수 있습니다. 우리의 주입 수술은 큰 동물 모델에서 혈전증 들어, 티 등 biomaterials의 성향을 테스트하실 수 있습니다. 우리는 돼지가이 절차를 용납되는이 주입에만 최소한의 출혈과 EPC 계층 중단없이 달성될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리 EPC – 줄지어 튜브도 하부 대정 맥의 prothrombotic 낮은 전단 환경에서 특허 남아 반면 맨 티 튜브가 완전히 occludes되는 t "> 그림 7 보여줍니다. 또한, 찬란 – 라벨 세포 합류 레이어의 존재를 확인 이 방법의 성공은 그림 8에 표시됩니다. 그림 1. autologous 내피 전구 세포 (EPC) 시딩 실험의 도식. 첫째, 주변 혈액은 돼지에서 얻을 수 있습니다. 다음 EPCs은 혈액으로부터 격리와 문화에 확장됩니다. EPCs 그때 그때 수술 세포 격리되었던에서 같은 돼지의 하부 베나의 정맥에 심어있는 티타늄 (TI) 튜브 장치를 한 줄에하는 데 사용됩니다. 그림 2. 문화 EPCs, 절연 절차 다음 약 7 일 (이미징 카메라와 QCapture 소프트웨어 거꾸로 Leica DMIL 현미경과 몇 군데)의 대표 콜로니. 이전 어셈블리에 대한 그림 3. 티 튜브 섹션. 티 관은 길이 방향 3 동등한 부분으로 절단, 그리고 4.5 cm 길이로 절단합니다. 티 섹션의 내부 표면은 표시 구덩이를 제거하는 탁상 그라인더와 에머리 옷감을 사용하여 연마하고 있습니다. 그림 4. PVC 열 수축 튜브 (파란색)과 열 총을 들고 티 튜브 섹션의 조립. 티 섹션은 티 섹션을 통해 확장 및 티 튜브 내경의 크기와 일치하는 가공 알루미늄 심봉에서 지원됩니다. 그림 5 모든 구성 요소를 보여주는 티타늄 튜브 조립, :. luer 캡, 주사기 '머리 기사', 실리콘 튜브, 그리고 티 튜브 PVC 랩 (파란색)과 함께. 어셈블리는 외과 사용하기 전에 살균 함께 넣어이다. 그림 6. 모터, 플랫폼을 보여주는 인큐베이터 안에 티 튜브 시딩 설정은, 알루미늄 주사기 홀더, 티 튜브 어셈블리, 5 CC 주사기를 가공. 참고 : 어셈블리가 시각화의 목적으로 보호 살균 칼집없이 표시됩니다. 그림 7. 주입 수술 대표 총 결과입니다. 돼지의 하부 대정 맥 (IVC)에 이식 후 관리 베어 메탈 티 튜브의 (A) 최종 볼 수 있습니다. 튜브 루멘 완전히 고체로 응고 occluded 있습니다. EPC 번시드인 티 튜브의 (B) 최종 전망 주입 후가. 튜브 루멘 완전히 특허 분명하다. 컨트롤 (C)를 ​​해부보기 (베어) 티 튜브 삼일 주입 후 혈전증의 범위를 (실험은 동일한 결과를 3 주 기간까지 실시되었다) 표시. 3 일간의 주입 다음 티 튜브 표면에 그림 8. EPCs은 (QImaging QICAM로 직립 Leica DMRB 현미경과 몇 군데 디지털 카메라 및 이미지 프로 플러스 소프트웨어를 흑백). (A) 표면에 콘플루앙 전지 PKH26 미리 수술 라벨을 보여주는. EPCs의 (B) 콘플루앙 계층. 빨간색 : PKH26 미리 수술 라벨. 녹색 : EPC PECAM – 얼룩.