Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion
Summary
Hier beschreiben wir die Isolierung von CD133 exprimierenden Leber-Stammzellen und Krebsstammzellen aus ganz murinen Leber, ein Prozess, der Gewebe Verdauung, Anreicherung von Zellen und Durchflusszytometrie Isolierung erfordert. Wir gehören Methoden für fortgeschrittene Einzelzellisolierung und klonalen Expansion.
Abstract
Leber-Stammzellen oder ovale Zellen, vermehren sich während der chronischen Leberschädigung, und vorgeschlagen, sowohl in Hepatozyten und Cholangiozyten unterscheiden. Darüber hinaus sind Leber-Stammzellen angenommen, dass sie die Vorläufer für eine Teilmenge von Leberkrebs, Leberzellkarzinom werden. Eines der wichtigsten Herausforderungen für die Zelle Arbeit in einem festen Organ wie die Leber Stammzellen ist die Isolierung von einer seltenen Population von Zellen, für eine detaillierte Analyse. Zum Beispiel sind die überwiegende Mehrheit der Zellen in der Leber Hepatozyten (Parenchym-Fraktion), die deutlich größer ist als Nicht-Parenchymzellen sind. Durch die Anreicherung der spezifischen zellulären Kompartimenten der Leber (zB Parenchym-und Nicht-Parenchym-Fraktionen), und die Auswahl für die CD45-negativen Zellen, können wir an den Start Population von Stammzellen durch bereichern über 600-fold.The proceduresdetailed in diesem Bericht ermöglichen eine relativ seltene Population von Zellen aus einem Organ-effizient sortiert werden. Dieser Prozess kann bis isolateliver Stammzellen aus normalen murinen Leber sowie chronische Leberschäden Modelle, die eine erhöhte Leber Stammzellproliferation demonstrieren genutzt werden. Diese Methode hat klare Vorteile gegenüber Standard-Immunhistochemie von gefrorenen oder Formalin fixiert Leber als funktionelle Studien mit lebenden Zellen nach der ersten Co-Lokalisation Experimente durchgeführt werden können. Um das zu erreichen das Verfahren in diesem Bericht dargelegt wurde, ist eine funktionierende Beziehung mit einem Forschungs-basierte Durchflusszytometrie Kern stark gefördert wie die Details der FACS isoliert in hohem Maße auf spezialisierte Mess-und ausgeprägte Kenntnisse der grundlegenden Durchflusszytometrie Verfahren. Das spezifische Ziel dieses Prozesses ist es, eine Bevölkerung von Leber-Stammzellen, die klonal in vitro erweitert werden kann isolieren.
Protocol
Discussion
Anders als das blutbildende System, in dem hämatopoetischen Stammzellen sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung einer zellulären Differenzierung, das replacesnormal physiologischen turn-over von Leukozyten, rote Blutkörperchen und Blutplättchen, Leber Stammzellen oder erwachsenen Leber Vorläuferzellen, nicht in normalen Leber zu beteiligen Homöostase. 5,6 Nach einer akuten Schädigung der Leber oder teilweisen Hepatektomie, Hepatozyten, wie differenziert Leber Epithel, durchlaufen mehrere Runden der Proliferation, um die verlorenen Leber Masse zu ersetzen. 5,6 Nur bei chronischen Verletzungen sind Leber-Stammzellen beobachtet zu vermehren. 1,5 -11 Diese Erwachsenen, organspezifische Stammzellen werden vorgeschlagen, um sowohl in Hepatozyten und Cholangiozyten unterscheiden. 1,5-8 Interessanterweise ist die überwiegende Mehrheit von Leberkrebs auf dem Hintergrund der chronischen Verletzung entwickelt, und damit Leber-Stammzellen sind auch die Hypothese zu sein Vorläufer für eine Teilmenge von Leberkrebs. 2-4,12-17
Eine der wichtigsten Herausforderungen für die Zelle Arbeit in der Leber Stammzellen ist die Isolierung von seltenen Populationen von Zellen für die funktionelle Analyse. Zum Beispiel sind die überwiegende Mehrheit der Zellen in der Leber Hepatozyten, die deutlich größer als Cholangiozyten und andere kleinere nicht-Parenchymzellen sind. Durch das Brechen der ganzen Leber in Zellkompartimenten (große Hepatozyten – Parenchym-Fraktion und kleinere Zellen – nicht-parenchymatösen Fraktion) und weitere Auswahl für CD45 negativen Zellen (nicht-hämatopoetischen Zellen), können wir an den Start Population von Stammzellen durch bereichern über 600-fache. 1,18-21 Zu beachten ist, sind wir keineswegs darauf hinweist, dass die CD133 + Population ein 100% reines Stammzellen Bevölkerung ist, sondern ganz klar eine heterogene Population von Zellen mit unterschiedlichen Herkunft und Wiederbesiedlung Potenzial. Eine der wichtigsten Einschränkungen des Feldes Definitionen von Stammzellen und Vorläuferzellen. Wir verwenden den Begriff "Stammzelle" im weiteren Sinne in dieser Arbeit, aber in strengen Definition stellen CD133 + Nicht-Parenchymzellen ein bi-Linie Vorläufer-Population. Angesichts des Stands der aktuellen Stamm-und Vorläuferzellen Forschung in der Leber, gibt dieser Bericht einen Startplatz für die Ermittler, die in diesem Bereich interessiert sind. Als neuer Marker, entstehen wie EpCAM, 22,23 oder Transkriptionsfaktoren, wie Sox9, 24 sie eingebaut werden kann. Zum Beispiel haben wir eine ziemlich hohe Überlappung zwischen EpCAM + Zellen und CD133 + Zellen gefunden.
In diesem Bericht detailliert ein Verfahren zur Stammzellen isoliert von normalen murinen Leber sowie chronische Leberschäden Modelle, die zeigen, erhöhte Leberwerte Stammzellproliferation. Diese Methode hat klare Vorteile gegenüber Standard-Immunhistochemie von gefrorenen oder Formalin fixiert Leber als funktionelle Studien mit lebenden Zellen nach der Isolierung durchgeführt werden kann. 1,3,4 Die spezifische Ziel dieses Prozesses ist es, eine relativ reine Population von Leber-Stammzellen, die isolieren können klonal in vitro erweitert werden.
Die wichtigste Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Mehrzahl der Zellen isoliert werden nicht nach Durchflusszytometrie lebensfähig (siehe Abschnitt Fehlersuche). Dies ist das Ergebnis der Stunden benötigt, um die Zellen herzustellen, und die zahlreichen Verfahren erforderlich, um die Bevölkerung vor der Isolierung zu verfeinern. Wenn die Leber in einzelne Zell-Suspension für die sofortige FACS-Analyse verdaut ist, wird der Größenunterschied zwischen Hepatozyten und anderen Nicht-Parenchymzellen effektiv FACS Tor Schöpfung unmöglich. Wenn die Leber nicht Parenchymzellen verwendet werden, ohne Abspaltung von hämatopoetischen Zellen, besteht die Gefahr, dass eine erhebliche Anzahl von CD133 + Zellen hämatopoetischen Ursprungs sein kann der Anteil verunreinigen. Weiterhin wird durch die Bearbeitung der Zellen durch die Miltenyi Filter sind nur einzelne Zellen und sehr kleine Gruppen von Zellen gesammelt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe nicht verstopfen die FACS Einnahme Nadel.
Alternativen für dieses Verfahren sind Änderungen für jede alternative Zelloberflächenmarker, wie CD49f, EpCAM, oder eine Kombination von Markern, wie CD133 + EpCAM + Ein zweiter Bericht veröffentlicht, nutzt einen Dichtegradienten zu Leber-Stammzellen, die aus einem Nicht-Parenchym-Fraktion zu isolieren. Dieses Verfahren erfordert eine Ultra-Zentrifuge (8000 xg), fügt viel Zeit, um das Verfahren, und in unserer Erfahrung, deutlich vor FACS zellulären Ertrag und post-FACS Lebensfähigkeit reduziert. 8
Zukünftige Experimente sind ein breiteres Spektrum von Genexpressionsanalyse, einschließlich fetale Leber Gene, wie HNF3, HNF4α und αfp.In Zusätzlich können Western-Blot-Analyse und Immunzytochemie von exprimierten Proteinen genutzt werden, um RT-PCR-Ergebnisse von Zellen in Kultur zu bestätigen.
Ein Thema, zu beachten ist, neuere Arbeiten, die CD133-Expression auf Lebersternzellen identifiziert. 25 Wir haben jetzt routinemäßig Bildschirm unsere Proben für die Marker der Sternzellen (siehe Abschnitt Fehlersuche), und nicht identified signifikante Kontamination in unseren Fraktionen. Dies kann zu unterschiedlichen Techniken der Leber Verdauung und Zellisolation bezogen werden. 2,3,26
Basierend auf der Tatsache, dass die Mehrzahl der Zellen nicht sofort nach FACS isoliert lebensfähig, empfehlen wir, dass die Zellen ausplattiert werden, entweder als Bulk-CD133 + Zellen oder einzelne Zellen, vor Tieren zu verwenden. 5-7 Tage in vitro signifikant verbessert werden Ergebnisse der Tumor-Analyse. Darüber hinaus angesichts der Strapazen des Einzelzellisolierung, sollte diese nur durchgeführt, wenn Kolonien von Bulk-CD133 + isolierten Zellen erweitert werden kann. Eine genauere Diskussion der verschiedenen Kulturbedingungen und Gerüst Proteine, die zur Kultur Leber Stamm-und Vorläuferzellen verwendet werden kann, wurde auch von Lola Reid aus. Diese Arbeit bietet alternative Bedingungen und Modifikationen, die Ermittler in ihrem Forschungsprogramm integrieren kann einmal Basisisolierung Techniken beherrscht werden. 27,28 Dr. Reid Werk bietet auch eine detailliertere Analyse der Linie Biologie und Reifung von Leber-Stammzellen und Vorläuferzellen verpflichtet.
In Bezug auf die in vivo Tumor-Analyse hatten wir Erfolg mit frisch isolierten Zellen und Zellen von klonal expandierten CD133 +-Zellen in vitro, in erster Linie mit 1×10 6 Zellen. / – – Und in der Leber bestimmte PTEN – / – Wir haben ontwo genetische Stämme von chronischen Leberschädigung, die MAT1A konzentriert Mäuse, und wir haben beide Nacktmäusen und Wildtyp-Mäusen als Gastgeber für das Tumorwachstum eingesetzt. Nach unserer Erfahrung wird CD133 + Leber-Stammzellen nur Tumoren bilden, wenn sie aus signifikante Schädigung der Leber Modelle, die prä-maligne sind isoliert. Beachten Sie, dass die Tumoren aus CD133 + Zellen gebildet haben sowohl hepatozellulären Karzinoms und Gallengangskarzinom Funktionen, was auf eine Stammzell-oder Progenitorzellen Entstehung der Tumoren. 2-4,29
Follow-up-Arbeit nach Tumoren dokumentiert umfasst Standard-pathologischen Analyse von Tumorgewebe (H & E-Färbung) und immunhistochemische Färbung. Darüber hinaus können Tumoren zerkleinert und für die FACS-Analyse oder re-Kultur verdaut werden. 2-4,30
Zusammenfassend haben wir ein Verfahren zur Isolierung, Expansion und die grundlegende Charakterisierung von CD133 + Leber-Stammzellen und CD133 + Krebsstammzellen detailliert.
Trouble Shooting:
CD45 Kontamination:
Für Schritt 3, wenn es Kontamination von CD45 +-Zellen, die durch Zugabe eines CD45-FITC Ab vor FACS-Analyse und isoliert betrachtet werden können, um sicherzustellen, dass der CD45 Mikrobead Antikörper nicht abgelaufen ist und dass das Filtrat nur während sammelten die Filter wurde in den Magnethalter. Jede Filtrat gesammelt, während der Filter nicht in der magnetischen Halterung wird CD45 +-Zellen enthalten.
Niedrige Zellzahl:
Für die unverletzten Leber, die Gesamtzahl der CD133 + Nicht-Parenchym isoliert werden können weniger als 10.000. Diese Zellen sind selten in den ruhenden Leber. Für eine chronische Verletzung Modell, wie die DDC 0,1% Ernährung, wird die Zahl deutlich erhöhen zu 100.000 Zellen. Wenn die gesamte Zellzahl liegt deutlich unter diesen Zahlen ist die eine Sache zu prüfen, FACS Ab Färbung. Stellen Sie sicher, dass die CD133 Ab nicht abgelaufen ist, wie arm Färbung in eine schlechte Ausbeute führt. Darüber hinaus empfehlen wir die Durchführung einer FACS-Analyse der Leber nicht Parenchymzellen, um die relative Bevölkerung vor dem Versuch FACS isoliert zu bestimmen.
Low Lebensfähigkeit der Zellen nach FACS:
Eine der Fragen der Lebensfähigkeit können, wie die Zellen verarbeitet werden und über welchen Zeitraum bezogen werden. Im Idealfall sollte die gesamte Zelle Isolierung, die Schritte 1-4, ohne Verzögerungen zwischen den einzelnen Schritten durchgeführt und abgeschlossen werden am selben Tag. Jede wesentliche Verzögerung zwischen den Schritten 1-4 wird erheblich reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen. Ein zweites Problem im Zusammenhang mit Lebensfähigkeit der Zellen kann zum Mantel Druck für FACS Isolierung verwendet bezogen werden. Wir empfehlen die Verwendung einer geringeren Mantel Druck. Schließlich, nachdem die Zellen isoliert werden, sollten sie sofort vergoldet, als nennenswerte Lagerung auf Eis nach dem Sortieren reduzieren auch die Rentabilität.
CD133 + Nicht-Parenchym-Heterogenität:
Aktuelle Berichte zeigen, dass Lebersternzellen können auch CD133 Expression und haben einige Plastizität. 25 Darum, zusätzlich zur Überprüfung bi-Potenz Gene mit Albumin und Krt19, zusätzliche Überprüfung können Gene mit sternförmigen Zellen, wie saures Gliafaserprotein in assoziiert sind, zählen Ruhestrom Sternzellen und alpha-smooth muscle Aktin und Desmin in aktivierten Sternzellen. 3,4,26 Darüber hinaus stellt die CD133 + Population eine breitere Vorläufer-Population. Die Zugabe eines zweiten Marker, wie zB EpCAM, kann dazu beitragen, die Bevölkerung weiter zu verfeinern und zu begrenzen Heterogenität.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Rountree erkennt aktuelle Unterstützung der Kinder-Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 und R03DK088013, und die American Cancer Society Research Scholar Award, MGO-11651. Dr. Rountree erkennt an, dass dieses Verfahren ursprünglich entwickelt und verfeinert, während die Kinder Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850) finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
| CD45 microbeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E4127 | |
| DNase | Sigma | DN25 | 1 gram |
| Collagenase D | Roche | 1088874 | |
| Pronase | Roche | 0165921 | |
| 70 micron mesh strainer | Fisher | 352350 | |
| Omniscript RT | Quaigen | 205111 | 50 reactions |
| HotStarTaq | Quaigen | 203203 | |
| Miltenyi LD column | Miltenyi | 130-042-901 | |
| CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
| Laminin coated plates | BD | 354410 | 96 well |
| Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
| RNeasy Micro Kit | Quaigen | 74004 | 50 columns for 5×105 cells or less |
| Pharm Lyse | BD | 555899 | 10X concentration |
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