Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish
Summary
Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.
Abstract
La possibilità di etichettare in modo differenziato le singole cellule ha importanti implicazioni nella biologia dello sviluppo. Per esempio, determinare in che modo ematopoietiche, lignaggi vasi linfatici e sanguigni sorgono in embrioni di sviluppo richiede la mappatura destino e lignaggio tracciamento di cellule precursori indifferenziati. Recentemente, proteine photoactivatable che includono: Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 e KikGR 9, 10 hanno ricevuto grande interesse come sonde cellulari traccia. Lo spettro di fluorescenza di queste proteine fotosensibili possono essere facilmente convertito con eccitazione UV, permettendo una popolazione di cellule per essere distinte da quelle adiacenti. Tuttavia, il photoefficiency della proteina attivata può limitare a lungo termine delle cellule inseguimento 11. In alternativa alle proteine photoactivatable, in gabbia fluoresceina destrano è stato ampiamente utilizzato in sistemi modello embrione 7, 12-14. Tradizionalmente, per uncage fluoresceina destrano, eccitazione UV da una casa lampada a fluorescenza o di un singolo fotone laser UV è stato utilizzato, tuttavia, le fonti di tale limite la risoluzione spaziale di fotoattivazione. Qui riportiamo un protocollo per mappare il destino, traccia discendenza, e rilevare le singole cellule marcate. Singole cellule in embrioni iniettati con gabbia fluoresceina destrano sono fotoattivati nel vicino infrarosso con impulsi laser prodotta da un laser a femtosecondi titanio zaffiro. Questo laser è consuetudine in tutti i microscopi confocale a due fotoni come il microscopio LSM 510 META NLO utilizzati in questo documento. Dal momento che i tessuti biologici è trasparente alla radiazione nel vicino infrarosso 15, gli impulsi laser può essere focalizzato in profondità all'interno dell'embrione senza uncaging cellule sopra o sotto il piano selezionato focale. Pertanto, non lineare assorbimento a due fotoni è indotta solo al centro geometrico di uncage fluoresceina destrano in una singola cella. Per rilevare la cella contenente Uncaged fluoresceina destrano, descriviamo un semplice protocollo immunoistochimica 16 a visualizzare rapidamente la cellula attivata. Il protocollo di attivazione e la rilevazione presentato in questo articolo è versatile e può essere applicato a qualsiasi modello di sistema.
Nota: I reagenti usati in questo protocollo si possono trovare nella tabella allegata alla fine dell'articolo.
Protocol
Discussion
Questo documento descrive un metodo versatile per la mappatura dei singoli il destino della cellula in base alla fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano. Uncaging di gabbia fluoresceina destrano in celle singole si ottiene utilizzando l'assorbimento a due fotoni di un laser a femtosecondi Mai Tai accoppiato al Zeiss LSM 510 META microscopio confocale. Uncaged fluoresceina destrano nelle cellule fotoattivati è rapidamente visualizzato usando una semplice procedura di immunoistochimica.
In questo protocollo i due fotoni di lunghezza d'onda di assorbimento per fotoattivazione di gabbia fluoresceina destrano è di 740 nm. Questa lunghezza d'onda è stato determinato sperimentalmente da photoactivating gabbia fluoresceina destrano embrioni di tipo selvatico iniettato. La lunghezza d'onda di eccitazione laser è stato variato dal 600-800 nm, e la presenza o assenza di fluoresceina fluorescenza post-attivazione era qualitativamente determinato. Abbiamo scoperto che 740 nm prodotta il più forte segnale di attivazione seguenti fluoresceina. Idealmente, 740 nm dovrebbe funzionare per tutti i sistemi modello, tuttavia, si consiglia di testare una vasta gamma di lunghezze d'onda per determinare l'ottimale a due fotoni di lunghezza d'onda di eccitazione per il campione.
In gabbia con fluoresceina destrano tipo selvatico embrioni iniettati, per ogni due-fotone di lunghezza d'onda di eccitazione testato anche variato la potenza media del laser. Per una lunghezza d'onda di eccitazione di 740 nm, una potenza media del laser di 47 mW prodotto un segnale fluoresceina più forte nella regione attivata rispetto a potenze inferiori laser media. Potenze superiori media del laser non ha prodotto segnali fluoresceina più forte, ma l'ablazione indotta del tessuto. Dato che gli impulsi laser a femtosecondi sono efficienti a ablazione dei tessuti biologici 15, si consiglia di determinare la potenza media soglia laser per fotoattivazione che evita l'ablazione dei tessuti.
Assorbimento a due fotoni si verifica all'interno di un volume di interazione di piccole dimensioni. Per garantire corretto funzionamento del dispositivo in gabbia con fluoresceina destrano, la cellula deve essere messa a fuoco corretta. Nel protocollo di cui sopra, le cellule GFP positive sono state contemporaneamente ripreso a luce bianca per confermare la messa a fuoco delle cellule. Pertanto, l'acquisizione di luce bianca, oltre ad altri canali è consigliabile. Dopo aver confermato fuoco delle cellule, il nostro protocollo suggerisce di ingrandimento della cellula attivata. Un fattore di zoom da 50 a 70 è suggerito, tuttavia, questo valore dipende dalla dimensione della cellula prescelta. Aumentando lo zoom isola la cellula attivata dalle cellule adiacenti, e limita l'area di scansione di due fotoni di attivazione. Idealmente, l'area di scansione dovrebbe coprire una vasta area della cellula.
Rilevazione di singole cellule attivate richiede che la colorazione di fondo essere minimo. Nel protocollo immunolocalizzazione sopra, è importante che il campione è bloccato in tampone di bloccaggio da 5 a 6 ore (punto 4.13). Durante lo sviluppo di NBT / BCIP, Uncaged fluoresceina destrano dovrebbe diventare visibile in 10 a 20 minuti. Se la colorazione di fondo è forte, si consiglia un tempo più lungo blocco e lava aggiuntive per rimuovere gli anticorpi (punto 4.17).
Le figure 1 e 2 forniscono risultati rappresentativi di fotoattivazione e immunolocalizzazione. Nella Figura 1, i primi 1 – a 2-cellule embrioni stadio tipo selvatico in gabbia sono stati iniettati con fluoresceina destrano. Gli embrioni sono stati sollevati a somitogenesis metà e montato in basso punto di fusione agarosio con l'orientamento laterale. Figura 1 (a, b) raffigurano campo chiaro e le immagini fluorescenti dell'embrione prima fotoattivazione. La prova che l'embrione è rimasto Uncaged è dimostrato dall'assenza di fluoresceina fluorescenza nella figura 1 (b). Una piccola regione all'interno di un somite è stato attivato con una lunghezza d'onda di 740 nm per 31 secondi utilizzando un laser di potenza media di 47 mW, Figura 1 (c, freccia). Post-attivazione, a due fotoni uncaging di fluoresceina destrano è verificato come dimostrano la fluorescenza della zona attiva, Figura 1 (d, freccia). Attivazione non è stato accompagnato da ablazione laser, come il tessuto somitic rimasta intatta, Figura 1 (c). La figura 2 mostra l'immunolocalizzazione di Uncaged fluoresceina destrano. Una piccola regione del mesoderma piastra laterale di un 10-somite embrione scena era fotoattivati utilizzando i parametri laser stesso, come indicato in Figura 1. L'embrione è stato sollevato e trattati con 4,1 passi attraverso 4.20. La freccia nella Figura 2 individua la regione attiva, come indicato da un accumulo di precipitato blu. Solo la posizione attiva è chiaramente individuata senza interferire colorazione di fondo.
Preparazione di soluzioni:
1 X PBT (1 L)
10 X 100 ml PBS
2 g di BSA
10 ml di Tween 20%
10 X PBS (1 L)
80 g di NaCl
2 g di KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g di KH 2 PO 4
DDH 2 O a 1 L
pH a 7,3
Paraformaldeide 4% (160 ml)
32% paraformaldeide (due flaconcini da 10 ml)
8 mL 20 X PBS
132 ml DDH 2 O
1 ml di NaCl 5 M
2,5 ml 1 M MgCl 2
5 ml 1 M Tris pH 9,5
250 microlitri Tween 20%
41,25 mL DDH 2 O
Anticorpi soluzione (per 1 campione)
5,5 microlitri polvere Acetone
40 microlitri PBT
LS 0,8 microlitri
0,1 microlitri anti-fluoresceina-AP anticorpi
2% LS (360 microlitri per 1 campione)
7,2 microlitri LS 100%
352,8 microlitri PBT
1 X Danieau media (1 L) ‡
11,6 mL 5 M NaCl
700 microlitri 1 M KCl
400 microlitri 1 M MgSO 4
600 microlitri 1 M di Ca (NO 3) 2
5 ml 1 M HEPES
DDH 2 O a 1 L
regolare il pH a 7,6
‡ Danieau è una soluzione salina ideale per l'allevamento di embrioni di zebrafish dechorionated. Altri mezzi di comunicazione possono essere utilizzati, purché siano correttamente con soluzioni isotoniche osmolarità (~ 300 mOsm per zebrafish)
NBT magazzino (1 ml)
50 mg Nitro Blu tetrazolo
0,7 ml di anidride dimetilformamide
0,3 mL DDH 2 O
BCIP magazzino (1 ml)
50 mg di 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolil
1 ml di anidride dimetilformamide
NBT / BCIP soluzione di sviluppo
1 ml di buffer AP
4,5 microlitri magazzino NBT
3,5 microlitri magazzino BCIP
Acetone polvere
- Selezionate 20 pesci adulti e congelare in azoto liquido.
- Macinare il pesce congelato con un mortaio e pestello in polvere.
- Trasferire la polvere di pesce in un tubo da 50 ml.
- Riempire il tubo conico con 100% di acetone. Vortice del tubo.
- Gira il tubo a max rpm per 10 minuti. Scartare il surnatante.
- Lavare il pellet altre 3 volte in 100% acetone e girare il tubo a max rpm per 10 minuti. Con l'ultimo lavaggio del surnatante deve apparire chiaro.
- Aggiungere 100 acetone% al pellet di nuovo e lasciare che il tubo di riposare a temperatura ambiente. Le particelle più dense si sistemerà, mentre le particelle più fini rimarrà in sospensione.
- Decantare le particelle in un nuovo tubo. Aliquota della soluzione polvere in tubi separati e conservarli a -20 ° C.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo J. Chen per la fornitura del gabbia fluoresceina destrano protocollo di sintesi. Questa ricerca è stata sostenuta dal marzo del premio Dimes 5-FY09-78, l'American Heart Association 09BGIA2090075 premio, e il NIH / NHLBI premio HL107369 R01-01 per SS Un ringraziamento speciale a C. Closson per la sua assistenza microscopia.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
Riferimenti
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 .
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
