Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

1. Transfectie van 293TN Cellen met Packaging Plasmids en de expressie-construct Zaad 7,0 tot 8,0 x 10 6 293TN cellen per 15 cm2 petrischaal in 20 ml kweekmedium met DMEM medium aangevuld met 4 mM L-glutamine, 4,5 g / l glucose en foetaal runderserum (10%) zonder antibiotica. Groei gedurende 18-24 uur bij 37 ° C met 5% CO2, zodat de celdichtheid 60-80% confluentie bereikt bij de transfectie. In sommige gevallen kan het nodig zijn zaad meerdere platen cellen om een ​​voldoende hoge titer voor transductie van doelcellen verkrijgen. Voor elke plaat van cellen, voeg 1,6 ml serum-vrij DMEM tot een autoclaaf 2 ml Eppendorff buis. Voeg 45 ul pPACKH1 of pPACKF1 en 4,5 ug van uw lentivector te maken die aan de DMEM en meng door en neer te pipetteren. Voeg 55 ul van PureFection in dezelfde buis. Vortex gedurende 10 seconden. Incubeer de DMEM-plasmide-PureFection mengsel bij kamertemperatuur fof 15 minuten. Voeg de DMEM-plasmide-PureFection mengsel aan de weefselkweek plaat druppelsgewijs en schud zachtjes gelijkmatig te verspreiden in de hele plaat. Breng de schotel naar de incubator en groeien bij 37 ° C met 5% CO2. Het is niet nodig om de media veranderen na transfectie. Als uw lentivector constructie drukt een gen dat codeert voor een fluorescerend eiwit als GFP, controleert u de cellen onder een microscoop 12-24 uur na transfectie. Je moet in staat zijn om> 90% GFP-positieve cellen te zien, wat aangeeft dat de transfectie is geslaagd. Verzamelt de celkweeksupernatant na 48 en 72 uur in een 50 ml steriel centrifugebuis. Deze celcultuur supernatant bevat nu besmettelijke pseudoviral deeltjes. (Volg de aanbevolen richtlijnen voor het werken met BSL-2 veiligheidsklasse.) Centrifugeer bij 1.500 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur pellet de cellulaire puin. Breng de virale supernatant naar een nieuwe buis, verzekert dat de pellet verstoren. 293TN cellen die zijn gebruikt voor virale verpakking moet van een biologisch container en niet worden gebruikt voor volgende ronden van virale verpakking. 2. Concentratie van de Viral Supernatant Voeg 1 volume koude (4 ° C) PEG-it Virus Precipitatieoplossing elke 4 delen lentivirus deeltjes bevattende supernatant. Precipitatie van lentivirus deeltjes van grote hoeveelheden kunnen worden bereikt met Corning 250 ml polypropyleen centrifugebuis. Meng de oplossing door het omkeren van de buizen een paar keer, maar niet vortex het mengsel. Koel de oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 12 uur (tot 4 dagen zijn). Niet schudden of draaien de buizen tijdens de koeling stap. Centrifugeer de supernatant / PEG-het mengsel bij 1500 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Na centrifugeren de lentivirale deeltjes als een beige of wit pellet aan de bodem van de buis. Giet de supernatant. Verwijder alle sporen van vocht door aspiratie, zorg ervoor dat u de neergeslagen lentivirale deeltjes in de pellet te verstoren. Spoor van residuele PEG-zal het virus verdunnen (waardoor de titer) maar niet de integriteit van de doelwitcellen, omdat PEG-het inert en niet giftig beïnvloeden. Resuspenderen en combineren lentivirale deeltjes in 1/100 van de oorspronkelijke volume koude (4 ° C), steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing of DMEM dat 25 mM HEPES buffer. Aliquot in steriele cryogene flesjes en bewaar bij -70 ° C tot aan gebruik. 3. Virale Titering en transductie van target cellen Wij raden titering de lentivirale deeltjes voordat transduceren de doelcellen-of-interest en de berekening van de juiste multipliciteit van infectie (MOI) voor de doelcellen voor de samenhang tussen experimenten. Voor virale titering, raden wij u aan HT1080 cellen als een eenvoudig te infecteren positieve controle lijn. Plgemak er rekening mee dat de titering protocol omvat transduceren HT1080 cellen met een kleine hoeveelheid van de lentivirale deeltjes je hebt verpakt. Zodra de titer bekend is, kan de doelcellen of interest worden getransduceerd met de geproduceerde lentivirale deeltjes. Een adviseren titering protocol is te vinden op: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Plaat 50.000 doelcellen-of-interest per putje in een 24-wells plaat in celcultuur media. Gebruik de media dat de cellen normaal worden gekweekt binnen Grow de cellen 's nachts op hun specifieke kweekomstandigheden. Cellen moet 50 tot 70% confluent op de dag van transductie. Op de dag van transductie, zuigen de media uit de cellen. Combineer kweekmedium met TransDux een 1 x eindconcentratie (bijvoorbeeld 2,5 pi TransDux 500 ul kweekmedium). Breng het TransDux-cell kweekmedium mengsel aan elke well. Pipetteer de juiste hoeveelheid virus die overeenkomt met de optimale MOI de doelcellen in elk putje. Indien de optimale MOI onbekend, raden proberen een aantal verschillende MOIS (zoals een MOI 1, 2 en 5 gemakkelijk te infecteren weefselkweekcellen en een MOI 1, 10 en 20 voor moeilijk -infecteren primaire cellen). Indien de concentratie van de deeltjes lentivirale niet bekend is (als bepaald door een virus titering protocol) kunnen verschillende hoeveelheden virus worden beproefd, zoals 1, 2 en 5 ul virus. Virus kunnen blijven in contact met de doelcellen tot 72 uur. Verdere experimenten met de getransduceerde doelwitcellen of interest kan 72 uur begonnen na transductie, wanneer de virale construct is geïntegreerd in het gastheercelgenoom. Wijzig de medium en passage de doelcellen-of-interest op basis van hun specifieke behoeften. 4. Representatieve resultaten <pclass = "jove_step"> Transfectie van 293TN cellen Het uitgangspunt dichtheid van de 293TN cellen is cruciaal voor een succesvolle virale verpakking. 293TN cellen moeten 60 80% confluente de dag van transfectie (Figuur 2). Als de 293TN cellen minder dan 60% samenvloeiing, laat ze nog een paar uur te groeien voordat u de transfectie. Als de cellen 293TN> 80% confluent, moeten zij worden uitgeplaat voor transfectie. Bij gebruik van een lentivector expressie GFP, ten minste 90% van de cellen 293TN fluoresceren groen 24 uur na de transfectie, aan te geven dat transfectie (Figuur 3). Indien minder dan 90% van de cellen GFP-positieve, niet naar de volgende stap omdat dit dat de transfectie niet succesvol was, en de virale titers laag zijn. In plaats daarvan plaat nieuwe 293TN cellen en opnieuw te beginnen, zorg ervoor dat de 293TN cellen op de juiste celdichtheid voor transfecteren. 293TN cellen kunnen trekken uit de weefselkweek platen 48-72 uur na transfectie. Dit heeft geen negatieve invloed hebben op de productie van lentivirale deeltjes. Titering met HT1080 Cellen Virale titers kan worden berekend met behulp van Global ultrasnelle SBI's Titering kit volgens de instructies van de fabrikant. Het systeem maakt gebruik van virale qPCR integratie van de sequentie WPRE meten van de lentivirale in HT1080 cellen en vergelijkt dit met een standaard curve, gebaseerd op een genomische referentiesequentie nauwkeurig meten infectieuze eenheden per ml (Fig. 4). Transductie van doelwitcellen Bij gebruik van lentivirale deeltjes het uitdrukken van een constitutief actieve GFP merker, moet GFP positieve cellen beginnen te verschijnen binnen 12-24 uur na transductie, als de transductie reactie werkt. GFP-expressie moet worden voortgezet na de lentivirale constructie stabiel te integreren met thij gastheercelgenoom. Als transduceren met verschillende MOIS, moet de GFP-fluorescentie ongeveer overeen met de MOI, waar lage MOIS tonen minder GFP-fluorescentie en hoger MOIS blijkt een toegenomen GFP-fluorescentie (figuur 5). Figuur 1. Overzicht van de virale productie protocol. De lentivector en PPACK verpakking plasmiden worden gemengd en geco-transfecteerd in cellen 293TN. Na 48 -72 uur wordt het virale supernatant verzameld en virale deeltjes worden neergeslagen met PEG-it. Na titering de lentivirale deeltjes, kunnen ze worden gebruikt om de doelcellen-of-interest transduceren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 2. Fase contrast beeld van 293TN cellen. Cell density moet 60-80% confluent de dag van de transfectie. Figuur 3. Fluorescent beeld van GFP-positieve 293TN cellen 24 uur na transfectie met Purefection, pPACKH1 en een lentivector construct codeert GFP. Figuur 4. WPRE qPCR resultaten en de standaard curve verkregen met behulp van Global ultrasnelle SBI's Titering kit om MOI en bijbehorende titer van verpakte virale deeltjes te berekenen. Figuur 5. Fluorescent beelden HT1080 cellen getransduceerd met toenemende hoeveelheden lentivirus. Foto's zijn vanaf 72 uur na transductie.