Aislamiento y Caracterización de Hoechst ^Baja CD45 ^Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

1. Aislamiento de pulmón Sacrificio de los ratones adultos (8-10 semanas de edad, 18 a 20 g; C57Bl6J) los ratones con una sobredosis de isoflurano seguido por exanguinación mediante una técnica estéril. Perfiles pueden variar ligeramente entre las cepas. Extraer quirúrgicamente el diafragma, abrir la cavidad torácica por el corte de la caja torácica lateralmente a cada lado del ratón. Lavar la sangre de los pulmones por perfusión del ventrículo derecho del corazón con cuidado usando 3-5ml de tampón fosfato salino (PBS). Diseccionar los lóbulos pulmonares de retirar la tráquea, los bronquios grandes y colocar en una placa de Petri llena de solución salina tamponada Hanks (HBSS). Tras la recolección de todos los lóbulos pulmonares con fórceps se utilizan para colocar el tejido en la tapa del plato. El tejido se picada en trozos pequeños con bisturí desechable, con suficiente líquido para mantener la humedad, pero no tanto que flotan y se mueven. La disección de un miembro posterior de uno de los ratones y aislar la médula ósea para su uso como un control de tinción para establecer la flow citometría de puertas. Mancha de la médula ósea (MO) como se describió anteriormente 1. 2. Preparación de una suspensión de células individuales del tejido pulmonar Cada pulmón se digiere con un peso del tejido optimizado en relación al volumen de 0,2 g: 5ml de pre-calentado 0,2% Worthington tipo 2 colagenasa (Worthington Bioquímicos, Lakewood, NJ, cat # LS004202) disuelto en HBSS estéril. La mezcla se sumerge en un baño de agua 37 ° C durante 30 min 2,3. Triturar la muestra bien hasta que digerir el tejido pulmonar fluye fácilmente a través de una pipeta de 10 ml (aproximadamente 10 repeticiones). Incubar durante otros 15 minutos a 37 ° C para completar el tejido digiere y se asegura una suspensión de células individuales más uniforme. Diluir la suspensión de células de pulmón con HBSS y triturar con una pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos residuales del tejido. Filtrar la suspensión utilizando un colador para eliminar células 70μM fragmentos sin digerir el tejido. Muestra se puede dividir en multipltubos cónicos e en este punto para evitar la sobrecarga de un colador celular y disminuir el tiempo. Pellet la suspensión celular durante 10 minutos a 1500 rpm y se decanta el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular suavemente con la temperatura ambiente RBC tampón de lisis (eBiosciences, San Diego, CA, cat # 00-4333-57) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir un volumen igual de HBSS para desactivar el buffer de lisis y el filtro de la suspensión celular de células utilizando un colador para eliminar los restos 40μM y agregados de células. Pipeta 10μl de cada muestra que se tiñen y contar el número de células, tanto para el pulmón y muestras BM utilizando un hemocitómetro. Nota: El registro del volumen total de las células. Pellet la suspensión de células individuales de las células del pulmón por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos. Resuspender los pulmones y las células BM en 1×10 6 células / ml en precalentado (37 ° C) + DMEM (Dulbecco modificado de Eagle medio, alto nivel de glucosa (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) que contiene 2% fetal BOVIne suero (FBS) y HEPES 10 mM. Preparar una solución de 1mg/ml de colorante Hoechst 33342 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) en el agua y el filtro de esterilización de 1,4. El colorante Hoechst se puede almacenar en alícuotas a -80 ° C. Agregar colorante Hoescht 33342 a una concentración final de 5μg/ml (una dilución de 200 veces de un depósito 1mg/ml) a la suspensión de células individuales. Mezclar suavemente las células por la inversión e incubar a 37 ° C baño de agua durante exactamente 90 minutos. 3. Tinción y preparación de la suspensión de pulmón de células para el análisis de citometría de flujo Después de 90 minutos todas las medidas con las células del pulmón Hoechst manchadas deben ser ejecutados a 4 ° C o en hielo para evitar flujo de salida de medio de contraste. Que sedimenten las células por centrifugación a 1500 rpm durante 10 min a 4 ° C y se resuspenden las células en helado tinción de amortiguación (PBS 2% de SFB). Resuspender las células a una concentración de no más de 1×10 7 células / tubo con 300-600μl de PBS que contenía 2S y HEPES 10 mM. Añadir adecuadamente risita anticuerpos CD45 (por lo general la dilución 1:200 de CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA, cat # 559864) en el pulmón y las muestras BM Incubar en hielo durante 10-15 minutos Incluye un control sin manchas durante la.. procedimiento experimental es útil para establecer el análisis de las puertas. Precipitar las células a 4 ° C por 5 min a 1500 rpm. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de tampón de tinción refrigerados (PBS 2% de SFB). Transferencia a los tubos enfriados previamente snap de polipropileno tapa (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). Añadir yoduro de propidio (PI, las acciones de 200μg/ml en PBS) a las muestras para una concentración final de 2μg/ml para excluir las células muertas. PI debe ser utilizado en combinación con el colorante Hoechst 33342 para lograr el perfil correcto de fluorescencia en el análisis de citometría de flujo. Tubos de tienda en el hielo, protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo. 4. El análisis de citometría de flujo para definir y aislarun pulmón de células madre mesenquimales (MSC pulmón) Población que utiliza el reactivo de Hoechst Eflujo para detectar un lado la población (SP) Este ensayo tiene los requisitos siguientes instrumentos: 488 nm y láser UV (350 a 355 nm) 2 detectores en el camino láser UV de color azul (450/65) y filtros de color rojo (675/50). El detector de color rojo UV debe tener una alta sensibilidad para la luz roja. Esto puede ser un problema con los clasificadores celulares viejos. Chiller para mantener la unidad de la muestra a 50-10 º C. Alinear los láseres y preparado para la selección de células siguiendo el protocolo del fabricante. Recoger la roja (eje x) y azul (eje Y) las señales de Hoechst utilizando una escala lineal. Ajustar los voltajes de tubo fotomultiplicador colocar el pico G0/G1 en la parte superior derecha del centro de la parcela para permitir la visualización adecuada de la población hemisferio posterior. Una parte de la fase S y todo el G2 del ciclo celular puede ser fuera de escala en la parte superior derecha de la trama. El SIG azulnal es relativamente brillante, mientras que la señal roja es tenue. Típica XDP MoFlo (Beckman Coulter, Miami, FL) voltajes son 425 para el azul y 650 para el rojo. Las células muertas son cerradas a cabo con PI. La norma camino PI (excitación 488 nm, emisión 630 nm) pueden ser utilizados. Por otra parte, PI también está entusiasmado por el láser UV y la población de células muertas se encuentra fuera de escala en el lado derecho de la población lateral (SP) trama. Esto alivia la necesidad de compensar la señal IP de cualquier otra fluorocromos como el FITC y PE. El método original de Goodell seguido los procedimientos de este último 5-7. Mantener un diferencial de presión relativamente baja durante el análisis y la clasificación para asegurar la resolución ajustada de la población de lado. El SP se presenta como un brazo lateral, aparte de la principal población de células de los pulmones. Esta población se denomina Hoechst baja. La baja Hoechst / SP se analiza para separar las poblaciones CD45 positivos y negativos utilizando un histograma 2,3 (Figura 1). Después de la selección y la compuerta de la Hoechst baja CD45 neg población MSC pulmón, las células pueden ser recogidos por la clasificación, ya sea como una población mixta en un tubo o de un solo aislar clones en una placa de 96 pocillos 3. Para la placa de clasificación de la desviación tipo corriente se ajusta al 25% para crear una corriente de tipo más vertical que suele utilizar para la clasificación del tubo. El objetivo de la corriente de clase mediante el envío de un pulso de corriente de prueba en la parte superior izquierda y luego la parte inferior derecha de una placa de 96 pocillos. Configure el software clasificador de mapa de la placa para depositar la cantidad deseada de células en cada pocillo. Para aislar clones de células individuales un MSC solo pulmón se clasifica en el pozo de una placa de 96 pocillos en 150μl de la cultura de los medios de comunicación (α-MEM suplementado con FBS al 20%). Después de la clase un 100μl de medio adicional se agrega. 5. Aislamiento, cultivo y caracterización de los pulmones y el MSC Clones Culture y la expansión de la población mixta MSC pulmón y clones de células individuales siguiente clasificación es idéntica con las condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% de CO 2 y humedad> 95%). Las células se permite que se adhieran aislamiento después de 16 horas. Los medios de comunicación se reemplaza cada 48 horas (α-MEM suplementado con FBS al 20%). Cuando las células empiezan a proliferar más rápidamente y llegar a la confluencia entre el 75-80% que se pasan (Figura 2). Las células se lavan con HBSS precalentado y se incubaron con tripsina al 0,5% / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, cat # 25-053-Cl) a 37 ° C durante menos de 2 min. Las células se determinan con un alcance invertido para confirmar la aparición de una suspensión celular. MSC pulmón se dividen en proporciones de 1:2 o 1:3 dependiendo de la tasa de proliferación actual de la cultura. La capacidad de las MSC de pulmón de diferenciarse en linajes mesenquimales tradicionales de los osteoblastos, adipocitos y condrocitos y su expresión en la superficie de células de aceptada marcadores mesenquimales is evaluados para cada preparación de células. El análisis citogenético de bandas también se realiza para confirmar la ausencia de graves anomalías cromosómicas 2,3,8-11. 6. La enumeración de MSC pulmón mediante un ensayo de formadoras de colonias (CFU-F) Diluir las células en un medio de MesenCult completo (Tecnologías de Células Madre, Vancouver, BC) a una concentración final de 1×10 6 células / ml. Realizar diluciones en serie para alcanzar las concentraciones finales en un plato de 100 mm de 6×10 4 células, 3×10 4 células, 1,5 x10 4 células y 0,75 x10 4 células en 10 ml de los medios de comunicación. Los análisis se realizaron por triplicado o duplicado para cada concentración de células y puede ser escalado para superficies pequeñas. Células en cultivo durante 10 días en condiciones normales. El día 10 las células se lavan con PBS y fijadas con metanol al 100% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Detectar la CFU-F colonias mediante la tinción con w / v 0.4% de solución de Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluido 1:20 con agua desionizada. Permita que las muestras se sequen al aire y cuantificar el número de colonias que contenga más de 25 células por colonia (Figura 3). 7. Análisis de las propiedades inmunomoduladoras de MSC pulmón en células T-proliferación y la apoptosis 6.25×10 4 células de pulmón por MSC y se sembraron en placas de 96 pocillos y se deja reposar durante la noche 2. Las células CD4 + a partir de bazos de receptor de células T (TCR) de ratones transgénicos, OT-II con las células T que reconocen el péptido 323-339 ovoalbúmina, son purificadas por el agotamiento de CD8 +, CD19 +, MHC-II + y CD25 + en las células con un clasificador de células Miltenyi AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Células presentadoras de antígeno (APC) se encuentran aisladas por la clasificación positiva de MHC-II + en las células 12. APC se fija en el 4% de paraformaldehído, se lavaron 3 veces en PBS / EDTA al 5% BSA/2mM, y cargado con 0.5μg/ml o 5μg / ml OVA323 péptido. Crecimiento simulado, arrestado APC se añaden a la MSC de pulmón en placas de 96 pocillos. Más del 95% de CD4 + puro 1×10 5 células se marcan con 5μM carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE, Sigma, St. Louis MO) en PBS y se incubó durante 5 min en la oscuridad, se lava con PBS-BSA al 5%, y añade a la APC y las células del pulmón MSC en DMEM 5% de SFB medios de comunicación. Células se incubaron durante 96 horas. T-células se tiñeron con anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); vbeta 5 (PE) y se analizaron utilizando un Miltenyi MacsQuant 7 citómetro de flujo del canal (Miltenyi, Aurburn, CA) y Flojo el análisis de software (Treestar, Ashland, Oregón). Proliferación se mide como la disminución de la intensidad media de fluorescencia de CFSE en comparación con el fondo, las células T marcadas con CFSE y no expuestos a la APC (Figura 4). Las células T se cuentan en este momento y de viabilidad determinado con exclusión del azul tripano. 8. Los resultados representativos: <p class="Jove_content"> Figura 1. Citometría de flujo análisis y definición de MSC pulmón. Suspensiones de células individuales de digerir el tejido pulmonar se tiñeron con Hoechst 33342 y analizadas por citometría de flujo para detectar diferencias en una. dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) y B. Hoechst azul y fluorescencia de color rojo. La presencia de un lado la población (SP) es visible en la puerta. La Hoechst baja SP se analiza para separar el C. CD45 negativas de la población de MSC pulmón. El CD45 positivo a las relaciones negativas de pulmón SP son típicamente 70:30 / 60:40. Figura 2. Aislamiento y cultivo de MSC pulmón. Tras la recogida de la MSC de pulmón por la clasificación de células, las células son colocadas en cajas de 30 mm con α-MEM supplemented con FBS al 20%. A. Las células recién ordenados parecen pequeños, redondos y brillantes. B. Después de aproximadamente 2-3 semanas, con colonias de un fenotipo mesenquimatoso, se hacen evidentes y la proliferación es más evidente. Figura 3. Enumeración de MSC por Formadoras de Colonias-fibroblastos de ensayo. Ampliado de pulmón MSC son colocadas por el protocolo descrito para el ensayo de CFU-F. A. Después de 10 días y las colonias Giemsa son evidentes. Colonias B. son grandes y están compuesto por un unos pocos cientos de células. C. Las células presentan un fenotipo mesenquimal. A & B, barra de escala = 0,5 cm, barra de escala C = 0,14 cm. Figura 4. CFSE células T basada Ensayo de proliferación. En ausencia de MSC pulmonar y la presencia de antigen las células presentadoras (APC) + / – ovoalbúmina (OVA) CD40 células T efectoras positivas demuestran una disminución en la intensidad de la CFSE que indica la proliferación (círculo rojo). La intensidad de fluorescencia CFSE de la membrana de las células T disminuye con cada estequiométricamente es decir, la división celular. con todas las divisiones. En la presencia de cáncer de pulmón MSC, APC + / – OVA, CD40 de células T efectoras positivas demuestran ningún cambio significativo en la intensidad de la CFSE que indica una falta de proliferación (círculo rojo).