Изоляция и характеристика Hoechst ^Низкий CD45 ^{Отрицательный} Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

1. Легкого Изоляция Жертвы взрослых мышей (8-10 недель в возрасте, 18-20 г; C57Bl6J) мышей с передозировкой изофлуран следует обескровливание с использованием стерильной техники. Профили будут незначительно отличаться между штаммами. Хирургическим путем удалить диафрагмы, открывают грудную полость, сокращая грудную клетку с боков на каждой стороне мыши. Флеш кровь из легких, перфузии правого желудочка сердца аккуратно с использованием 3-5mls фосфатного буферного раствора (PBS). Рассеките легких долях удаления трахеи и крупных бронхов и поместить в чашку Петри, заполненные Хэнкс буферном растворе (HBSS). После сбора всех долях легких щипцы используются для размещения ткани на крышке блюдо. Ткань затем фарш на мелкие части, используя одноразовые скальпели с достаточно жидким, чтобы держать их влажной, но не так много, что они плавают и двигаться. Рассеките задних конечностей одной из мышей и изолировать костного мозга для использования в качестве окрашивания управления для установки флош цитометрии ворота. Пятно костного мозга (КМ), как описано выше 1. 2. Подготовка суспензии отдельных клеток, из легких тканей Каждое легкое переваривается с помощью оптимизированной веса ткани к объему в 0,2 г: 5mls предварительно нагревается 0,2% Уортингтон 2 типа коллагеназы (Уортингтон Biochemicals, Лейквуд, штат Нью-Джерси; кошка # LS004202), растворенной в стерильной HBSS. Смесь погружают в 37 ° С на водяной бане 30 мин 2,3. Измельченного в порошок образца хорошо, пока переварить легочной ткани легко течет через пипетку 10 мл (примерно 10 повторений). Инкубировать еще 15 мин при 37 ° С для завершения ткани дайджесты и обеспечивает более равномерное суспензии отдельных клеток. Развести подвеску легкого с HBSS и растирают с 5 мл пипетки, чтобы рассеять остаточное фрагментов ткани. Фильтры подвески использованием 70μM сито ячейка для удаления непереваренных фрагментов ткани. Пример можно разделить на multiplэлектронной конических труб в этом месте, чтобы предотвратить перегрузку одной ячейки фильтра и уменьшить время. Гранул суспензии клеток в течение 10 мин при 1500 оборотах в минуту и ​​переливать супернатант. Ресуспендируют осадок клеток осторожно использованием комнатной температуре лизиса буфер (eBiosciences, Сан-Диего, Калифорния; кошка # 00-4333-57) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить равный объем HBSS для инактивации лизис буфером и фильтром клеточной суспензии использованием 40 мкм сито ячейка для удаления мусора и клеточных агрегатов. Внесите 10 мкл каждого образца, чтобы быть окрашены и подсчета количества клеток для обоих легких и BM образцов с использованием гемоцитометра. Примечание: запись общего объема клеток. Гранул суспензии отдельных клеток легких клетки центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин. Ресуспендируют обоих легких и Б. клеток 1х10 6 кл / мл в предварительно нагретого (37 ° С) DMEM + (среда Дульбекко изменение Орла, высокий уровень глюкозы (Gibco, Карлсбад, Калифорния; кошка # 11965-092), содержащей 2% фетальной Бовипе сыворотки (FBS) и 10 мМ HEPES. Подготовка 1mg/ml решение запас Hoechst 33342 красителя (Sigma Chemical Company, Сент-Луис, штат Миссури; кошка # B2261) в воде и фильтр стерилизовать 1,4. Красителем Hoechst могут быть сохранены как аликвоты при -80 ° C. Добавить Hoescht 33342 красителя конечной концентрации 5μg/ml (200x разбавления акции 1mg/ml) для суспензии отдельных клеток. Смешайте клетки, аккуратно инверсии и инкубировать в 37 ° С на водяной бане ровно 90 минут. 3. Окрашивание и приготовления суспензии клеток легких для анализа потока цитометрии Через 90 минут все шаги с Hoechst окрашенных клеток легких должны быть выполнены при температуре 4 ° С или на лед, чтобы предотвратить отток красителя. Гранул клетки центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируйте клеток в ледяного буфера окрашивания (PBS +2% FBS). Ресуспендируют клетки в концентрации не более 1х10 7 клеток / трубка с использованием 300-600μl ФСБ, содержащий 2S и 10 мМ HEPES. Добавить адекватно хихикал CD45 антитела (обычно 1:200 разбавление CD45-APC (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния; кошка # 559864) для легкого и Б. М. Инкубируйте образцы на льду в течение 10-15 мин в том числе неокрашенные контроль во время.. Экспериментальная процедура полезна для установки анализа ворота. Гранул клеток при 4 ° С в течение 5 мин при 1500 оборотах в минуту. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл охлажденного буфера окрашивания (PBS +2% FBS). Трансфер в prechilled трубы колпачок оснастки полипропилена (Fisherbrand, Шаумбург, Иллинойс, кошкой № 14-956-1D). Добавить пропидий йодида (PI, 200μg/ml акций PBS) для образцов для конечной концентрации 2μg/ml для исключения мертвых клеток. П. должен быть использован в сочетании с красителем Hoechst 33342, чтобы достигнуть правильного флуоресценции профиля на проточной цитометрии. Магазин труб на льду, защищенном от света месте, пока анализ потока цитометрии. 4. Анализ проточной цитометрии для определения и изолятСтволовые легких мезенхимальные клетки (легких MSC) Доля населения, использующего Hoechst красителя для обнаружения истечения стороны населения (SP) Этот анализ имеет следующие требования инструмента: 488 нм и УФ (350-355 нм) лазеры 2 детектора на пути УФ лазер с синим (450/65) и красной (675/50) фильтры. УФ-красный детектор должен иметь высокую чувствительность для красного сигнала. Это может быть проблема со взрослыми сортировщики клеток. Чиллер блок для поддержания образца при 5-10 ° С. Совместите лазеров и создан для сортировки клеток следующий протокол производителя. Сбор красный (ось абсцисс) и синий (ось у) Hoechst сигналы с помощью линейного масштаба. Настройте напряжение ФЭУ разместить G0/G1 пика в верхней правой части центра на участке, чтобы обеспечить адекватное отображение задней стороны населения. Часть S-фазе и весь G2 клеточного цикла может зашкаливать от правой верхней части участка. Синий сигналNAL сравнительно яркой в ​​то время как красный сигнал тусклым. Типичные MoFlo XDP (Beckman Coulter, Майами, Флорида) напряжения 425 для синего и 650 для красного. Мертвые клетки с использованием закрытого PI. Стандартный путь PI (возбуждение 488nm, эмиссия 630 нм) могут быть использованы. Кроме того, П. И. также возбуждались УФ-лазера и мертвые клетки лежит населения зашкаливать от правой стороны населения (SP) сюжет. Это избавляет от необходимости компенсировать PI сигнал от любого другого флуорохромами таких как FITC и PE. Оригинальный метод Goodell следуют последней процедуры 5-7. Поддерживайте относительно низкий перепад давления во время анализа и сортировки для обеспечения плотного разрешением стороны населения. СП выступает как сторона руки в стороне от основной популяции клетки легких. Это население называется Hoechst низким. Hoechst низкой / SP анализируется для отдельных CD45 положительных и отрицательных групп населения, используя гистограммы 2,3 (Figure 1). После выбора и литниковой из Hoechst низкой CD45 нег населения легких MSC клетки могут быть собраны путем сортировки или как смешанное население в трубку или отдельные клетки, чтобы изолировать клонов в 96-луночного планшета 3. Для сортировки пластины отклонения рода поток регулируется до 25%, чтобы создать более вертикальной рода поток, чем обычно используется для трубки сортировки. Цель рода поток, посылая импульс тест потока на верхней левой, а затем нижний правый лунку 96-луночного планшета. Установите пластину сортировщик программного обеспечения карте внести необходимое количество клеток в каждую лунку. Чтобы выделить одну ячейку клоны одного MSC легких сортируется в колодец 96-луночного планшета в 150 мкл культуральной среды (α-MEM дополнена с 20% FBS). После рода дополнительные 100 мкл среды добавлены. 5. Изоляция, культуры и характеристика легких MSC и клонами Culturэлектронной и расширение смешанным населением MSC легких и одного клона ячейки следующих сортировки идентичны с использованием стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% СО 2 и> 95% влажности). Клетки имеют право придерживаться следующих изоляции в течение 16 часов. Медиа менять каждые 48 часов (α-MEM дополнена с 20% FBS). Когда клетки начинают размножаться быстрее и достигают 75-80% от слияния они пассировать (рис. 2). Клетки промывали нагретого HBSS и инкубировали с 0,5% трипсина / ЭДТА (Cellgro, Манассас, Вирджиния, кошка № 25-053-Cl) при 37 ° С менее чем за 2 мин. Клетки контролировать с помощью перевернутого рамки для подтверждения появлением клеточной суспензии. Легкого MSC затем делится на отношение 1:2 или 1:3 в зависимости от текущей скорости распространения культуры. Способность легких MSC дифференцироваться в традиционных мезенхимальных линий остеобластов, адипоцитов и хондроцитов и их клеточной поверхности, выражение принято мезенхимальных маркеры яы оценивается для каждой ячейки подготовки. Цитогенетические полосы анализа осуществляется также, чтобы подтвердить отсутствие грубых хромосомных аномалий 2,3,8-11. 6. Перечень легких MSC использованием формирующих колонию анализ (КОЕ-Ф) Развести клетки в полной среде MesenCult (Технологии стволовых клеток, Ванкувер, Британская Колумбия) до конечной концентрации 1х10 6 кл / мл. Выполните серийных разведений для достижения окончательной концентрации в 100 мм блюдо 6×10 4 клеток, 3×10 4 ячейки, 1,5 х10 4 клеток и 0,75 х10 4 клеток в 10 мл средства массовой информации. Анализы проводятся в двух экземплярах или трех экземплярах для каждой концентрации клеток и может масштабироваться для небольших участков поверхности. Культура клетки в течение 10 дней в стандартных условиях. На 10-й день клетки промывали PBS и фиксируется с помощью 100% метанола в течение 5 минут при комнатной температуре. Определение КОЕ-Ф колоний путем окрашивания с 0,4% м / о решении окрашивания Гимзе(Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури), разбавленного 1:20 деионизированной водой. Разрешить образцы воздушно-сухой и количественно число колоний, содержащего более 25 клеток в колонии (рис. 3). 7. Анализ иммуномодулирующими свойствами легкого MSC на Т-клеточной пролиферации и апоптоза 6.25×10 4 легких MSC клеток на лунку высевают в 96-луночных планшетах и оставляют на ночь 2. CD4 + клетки селезенки Т-клеточный рецептор (TCR) трансгенных мышей, ОТ-II с Т-клетками, которые признают овальбумина 323-339 пептид, очищаются за счет истощения CD8 +, CD19 +, MHC-II + и CD25 + клеток с клетка Miltenyi AutoMACS сортировщик (Miltenyi, Оберн, Калифорния). Антиген представляющих клеток (АПК) изолированы положительно сортировки MHC-II + клеток 12. APC зафиксированы в 4% параформальдегида, промывают 3 раза в PBS / 5% BSA/2mM ЭДТА, с грузом 0.5μg/ml или 5 мкг / мл OVA323 пептида. Имитация, рост арестован APC добавляются в легких MSC в 96-луночных планшетах. Более 95% чистой CD4 + 1х10 5 клеток помечены 5 мкм карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE; Sigma, Сент-Луис MO) в PBS и инкубировали в течение 5 мин в темноте, промывали PBS-5% БСА, а затем добавил к APC и клетки легких MSC в DMEM 5% FBS СМИ. Затем клетки инкубировали в течение 96 часов. Т-клеток, которые затем окрашивали анти анти-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) и анализировали использованием Miltenyi MacsQuant 7 канале цитометра (Miltenyi, Aurburn, Калифорния) и FloJo анализ программного обеспечения (Treestar, Ashland, OR). Распространение определяется как снижение средней интенсивности флуоресцентного CFSE по сравнению с фоном, Т-клетки помечены CFSE и не подвергается APC (рис. 4). Т-клетки считаются в это время и жизнеспособность оценивали с исключением трипанового синий. 8. Представитель Результаты: <p class="Jove_content"> Рисунок 1. Проточной цитометрии анализа и определение легких MSC. Одноместный клеточные суспензии ткани легкого дайджеста окрашивали Hoechst 33342 и анализировали с помощью проточной цитометрии для определения различий в. рассеяния вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC) и B. Hoechst синий и красный флуоресценции. Наличие стороны населения (SP) видна в ворота. Hoechst низким SP затем анализируется для разделения Си. CD45 отрицательные населения легких MSC. CD45 положительного до отрицательного отношения легких СП, как правило, 70:30 / 60:40. Рисунок 2. Выделение и культуры легких MSC. После сбора легких MSC путем сортировки клеток, клетки помещают в 30мм блюда с использованием α-MEM supplemных ориентированных с 20% FBS.. Недавно отсортированы клетки появляются маленькие, круглые и яркие. B. Примерно через 2-3 недели колонии с мезенхимальных фенотип становятся очевидными и распространение является более очевидной. Рисунок 3. Перечисление MSC по формирующих колонию-фибробластов Пробирной. Расширенное легких MSC высевают в описанный протокол для КОЕ-Ф анализа. А. После 10 дней, а Гимза колонии очевидны. Б. Колонии большой и состоит из нескольких сотен клеток. C. клетки дисплей мезенхимальных фенотипа. & B, масштаб бар = 0,5 см; C Шкала бар = 0,14 см. Рисунок 4. CFSE основе Т-клеток распространения Пробирной. При отсутствии MSC легких и наличием antigeн представляющих клеток (АПК) + / – овальбумина (OVA) CD40 положительных эффекторных Т-клеток демонстрируют снижение интенсивности CFSE что указывает пролиферации (красный круг). CFSE интенсивности флуоресценции Т-клеточной мембраны уменьшается с каждым стехиометрически т.е. деление клеток. с каждым делением. При наличии легкого MSC, APC + / – OVA, CD40 положительных эффекторных Т-клеток демонстрирует никаких существенных изменений в CFSE интенсивности, что указывает на отсутствие пролиферации (красный круг).