Isolamento & Caracterização da Hoechst ^Baixa CD45 ^Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

1. Isolamento de pulmão Sacrifício ratos adultos (80-10 semanas de idade; 18-20 g; C57Bl6J) ratos com uma overdose de isoflurano seguido de sangria utilizando técnica estéril. Perfis variam ligeiramente entre cepas. Remover cirurgicamente o diafragma, abrir a cavidade torácica, cortando as costelas lateralmente em cada lado do mouse. Lavar o sangue dos pulmões irrigando o ventrículo direito do coração delicadamente usando 3-5mls de tampão fosfato (PBS). Dissecar os lobos pulmonares remoção traqueia e os brônquios grandes e coloque em um prato de petri preenchida com solução salina Hanks (HBSS). Após a coleta de todos os lobos pulmonares pinças são usadas para colocar o tecido sobre a tampa do prato. Tecido é então picada em pedaços pequenos utilizando bisturis descartáveis ​​com líquido suficiente para mantê-los úmidos, mas não tanto que eles flutuam e se mover. Dissecar um membro posterior de um dos camundongos e isolar a medula óssea a ser usado como um controle de coloração para definir o flow citometria de portas. Mancha da medula óssea (BM) como descrito anteriormente 1. 2. Preparação de uma suspensão de células do tecido pulmonar Único Cada pulmão é digerido usando um tecido de peso otimizado para relação de volume de 0,2 g: 5mls da pré-aquecido 0,2% Worthington tipo 2 colagenase (Bioquímicos Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissolvida em HBSS estéril. A mistura é imersa em um banho de água 37 ° C por 30 min 2,3. Triturar amostra bem até digerir tecido pulmonar flui facilmente através de uma pipeta de 10ml (aproximadamente 10 repetições). Incubar por 15 minutos adicionais a 37 ° C para completar o tecido digere e garante uma suspensão de células mais uniforme único. Diluir a suspensão de células de pulmão com HBSS e triturar com uma pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos de tecido residual. Filtrar a suspensão utilizando um coador de células 70μM para remover fragmentos de tecido sem serem digeridas. Amostra pode ser dividida em multipltubos cônicos e neste ponto para evitar a sobrecarga um coador de celular e diminuir o tempo. Pellet da suspensão de células por 10 min a 1500 rpm e decantar o sobrenadante. Ressuspender pellet celular usando delicadamente a temperatura ambiente RBC tampão de lise (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubar a RT por 5 min. Adicionar um volume igual de HBSS para inativar o tampão de lise e filtrar a suspensão de células usando um coador de células 40μM para remover detritos e agregados celulares. Pipetar 10μl de cada amostra a ser manchada e contagem de números de celular tanto para o pulmão e as amostras usando um hemocitômetro BM. Nota: registrar o volume total das células. Pellet a suspensão única célula de células do pulmão por centrifugação a 1500 rpm por 10 min. Ressuspender tanto pulmão e células BM em 1×10 6 células / ml no pré-aquecida (37 ° C) DMEM + (meio modificado Dulbecco Águia, glicose elevada (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092), contendo 2% Bovi fetalne soro (FBS) e HEPES 10mM. Prepare uma solução estoque 1mg/ml de Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) em água e filtro de esterilizar 1,4. O corante Hoechst pode ser armazenada como alíquotas a -80 ° C. Adicionar corante Hoescht 33342 para uma concentração final de 5μg/ml (a diluição de 200x de um estoque 1mg/ml) para a suspensão única célula. Misture delicadamente as células por inversão e incubar em banho-maria 37 ° C por exatamente 90 minutos. 3. Coloração e preparação da suspensão de células do pulmão para a Análise de Citometria de Fluxo Depois de 90 min todos os passos com as células do pulmão Hoechst manchado deve ser executado a 4 ° C ou em gelo para evitar efluxo corante. Agregar as células por centrifugação a 1500 rpm por 10 min a 4 ° C e ressuspender as células em ice-cold coloração tampão (PBS 2% FBS). Ressuspender as células em uma concentração não superior a 1×10 7 células / tubo com 300-600μl de PBS contendo 2S e HEPES 10mM. Adicionar tituladas de forma adequada de anticorpos CD45 (tipicamente 1:200 diluição de CD45-APC (BD PharMingen, San Diego, CA; cat # 559864) para o pulmão e as amostras BM Incubar no gelo por 10-15 min Incluindo um controle durante a imaculada.. procedimento experimental é útil para definir os portões análise. Células pelota a 4 ° C por 5 min a 1500 rpm. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 mL de tampão coloração refrigerados (PBS 2% FBS). Transferência para prechilled pressão tubos de polipropileno cap (Fisherbrand, Schaumburg, IL; cat # 14-956-1D). Adicionar iodeto de propídio (PI, 200μg/ml de ações em PBS) para as amostras para uma concentração final de 2μg/ml para excluir as células mortas. PI deve ser utilizado em combinação com o corante Hoechst 33342 para alcançar o perfil correto de fluorescência na análise por citometria de fluxo. Tubos de armazenamento em gelo, protegido da luz até a análise de citometria de fluxo. 4. Citometria de fluxo para definir e isolarum Pulmão de Células-Tronco Mesenquimais (pulmão MSC) População com corante Hoechst efluxo para detectar uma População Side (SP) Este ensaio tem os requisitos instrumento seguinte: 488 nm e UV (350-355 nm) lasers 2 detectores no caminho de laser UV com o azul (450/65) e (675/50) vermelho filtros. O detector UV vermelho deve ter alta sensibilidade para o sinal vermelho. Este pode ser um problema com a triagem mais velhos celular. Unidade de resfriador para manter a amostra a 50-10 ° C. Alinhar lasers e configurar para separação de células seguindo o protocolo do fabricante. Recolher o vermelho (eixo-x) e azul (eixo y) sinais Hoechst, usando uma escala linear. Ajustar as tensões tubo fotomultiplicador para colocar o pico G0/G1 no canto superior direito do centro sobre o enredo para permitir a exibição adequada da população lado de trás. Uma parte da fase S e G2 do total do ciclo celular pode ser fora de escala no canto superior direito da trama. O sig azulnal é relativamente brilhante enquanto o sinal vermelho é fraca. Típico MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) tensões são 425 para o azul e 650 para o vermelho. As células mortas são fechados por meio PI. O caminho padrão PI (excitação 488nm, emissão 630nm) pode ser usado. Alternativamente, PI também está animado com o laser UV ea população de células mortas está fora da escala do lado direito da população lado (SP) enredo. Isto alivia a necessidade de compensar o sinal PI a partir de qualquer outro, como fluorocromos FITC e PE. O método original seguido Goodell que estes últimos procedimentos 5-7. Manter um diferencial de pressão relativamente baixa durante a análise e triagem para garantir a resolução firme da população lado. A SP aparece como um braço do lado para além da população principal de células do pulmão. Esta população é denominado Hoechst baixo. A baixa Hoechst / SP é analisado para separar as populações CD45 positivo e negativo usando um 2,3 histograma (FIGURA 1). Após a selecção ea propagação do CD45 baixo Hoechst neg pulmão população MSC as células podem ser coletadas por triagem ou como uma população mista em um tubo ou uma única célula para isolar clones em uma placa de 96 poços 3. Para placa de classificação do desvio de fluxo tipo é ajustada para 25% para criar um fluxo tipo mais vertical do que que normalmente usado para classificação tubo. Aponte o tipo de fluxo através do envio de um pulso de corrente de teste para o canto superior esquerdo e inferior direito, em seguida, o poço de uma placa de 96 poços. Definir o classificador mapa da placa software para depositar o número desejado de células em cada poço. Para isolar clones uma única célula MSC único pulmão é classificado dentro do poço de uma placa de 96 poços em 150μl da cultura da mídia (α-MEM suplementado com SFB 20%). Após o ordenar um adicional de 100μl médio é adicionado. 5. Cultura, isolamento e caracterização de pulmão MSC e Clones Culture e expansão de população mista de pulmão MSC e clones única célula seguinte classificação é idêntica usando condições de cultura padrão (37 ° C, 5% CO 2 e> 95% de umidade). Células estão autorizados a aderir isolamento por 16 horas seguintes. Media é substituído a cada 48 horas (α-MEM suplementado com SFB 20%). Quando as células começam a proliferar mais rapidamente e atingir entre 75-80% confluência são várias passagens (Figura 2). Células são lavadas com HBSS pré-aquecida e incubadas com 0,5% de tripsina / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) a 37 ° C por menos de 2 min. Células são monitoradas através de um escopo invertida para confirmar a aparência de uma suspensão de células. MSC pulmão são divididos então em relação 1:2 ou 1:3, dependendo da taxa atual proliferação da cultura. A capacidade da MSC pulmão de se diferenciar em linhagens mesenquimais tradicionais de osteoblastos, adipócitos e condrócitos e sua expressão na superfície celular de marcadores aceita mesenquimais is avaliados para cada preparação celular. A análise citogenética de bandas também é realizada para confirmar a ausência de graves anomalias cromossômicas 2,3,8-11. 6. Enumeração de MSC de pulmão usando uma Assay Formadoras de Colônias (CFU-F) Diluir as células em meio MesenCult completa (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) para uma concentração final de 1×10 6 células / ml. Realizar diluições em série para atingir concentrações finais em um prato de 100 mm de 6×10 4 células, 3×10 4 células, 1,5 x10 4 células e 0,75 x10 4 células em 10ml de mídia. As análises são realizadas em triplicata duplicado ou para cada concentração de células e pode ser escalado para áreas menores superfície. Células de cultura por 10 dias em condições normais. No dia 10 as células são lavadas com PBS e fixadas com metanol 100% por 5 minutos em temperatura ambiente. Detectar as colônias CFU-F através da coloração com 0,4% de solução de coloração w / v Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluído 1:20 com água deionizada. Permitem que as amostras de ar seco e quantificar o número de colônias contendo mais de 25 células por colônia (Figura 3). 7. Análise das propriedades imunomoduladoras de MSC em pulmão de células T-Proliferação e Apoptose 6.25×10 4 células pulmonares MSC por poço são semeadas em placas de 96 poços e deixar repousar 2 durante a noite. CD4 + células de baço de t-cell receptor (TCR) camundongos transgênicos, OT-II com células T que reconhecem a ovalbumina 323-339 peptídeo, são purificados, esgotando CD8 +, CD19 +, MHC-II + e CD25 + células com Miltenyi um classificador de células AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Células apresentadoras de antígenos (APC) são isolados por positivamente classificação MHC-II + células 12. APC são fixados em paraformaldeído 4%, lavados três vezes em PBS / EDTA 5% BSA/2mM, e carregado com 0.5μg/ml ou 5μg / ml peptídeo OVA323. Crescimento, simulados preso APC são adicionados à MSC de pulmão em placas de 96 poços. Superior a 95% CD4 + pura 1×10 5 células são rotulados com 5m carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE; Sigma, St.Louis MO) em PBS e incubadas por 5 min no escuro, lavados com PBS-BSA 5%, e então adicionado ao APC e células MSC pulmão em DMEM 5% FBS mídia. Células são então incubadas por 96 horas. T-células são então coradas com anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) e analisadas usando um Miltenyi MacsQuant 7 citômetro de fluxo do canal (Miltenyi, Aurburn, CA) e Flojo análise software (Treestar, Ashland, OR). Proliferação é medida como a diminuição da intensidade de fluorescência média de CFSE em comparação com o fundo, as células T marcado com CFSE e não expostos a APC (Figura 4). As células T são contados neste momento e de viabilidade avaliada com exclusão de tripan blue. 8. Resultados representativos: <p class="Jove_content"> Figura análise de fluxo 1. Citometria e Definição de MSC Lung. Suspensões única célula de tecido pulmonar digerir são corados com Hoechst 33342 e analisados ​​por citometria de fluxo para detectar diferenças em A. dispersão para a frente (FSC) e dispersor lateral (SSC) e B. Hoechst azul e vermelho fluorescente. A presença de uma população lado (SP) é visível no portão. A Hoechst baixos SP é então analisado para separar o C. CD45 negativo da população MSC pulmão. O CD45 positivo para negativo de índices de pulmão SP normalmente são 70:30 / 60:40. Figura 2. Isolamento e Cultura da MSC Lung. Após a colheita dos MSC pulmão por separação de células, as células são banhados em pratos de 30 milímetros usando α-MEM supplemtura orientada com FBS 20%. A. Células recém-ordenados parecem pequenos, redondos e brilhantes. B. Após cerca de 2-3 colônias semanas com um fenótipo mesenquimal tornar-se evidente e proliferação é mais óbvio. Figura 3. Enumeração de MSC por Assay Formadoras de Colônias de fibroblastos. Expanded pulmão MSC são banhados por o protocolo descrito para o ensaio CFU-F. A. Depois de 10 dias e colônias Giemsa são evidentes. Colônias B. são grandes e composta por um algumas centenas de células. C. As células apresentam um fenótipo mesenquimal. A & B, bar Escala = 0,5 cm; C = 0,14 bar Escala cm. Figura 4. CFSE Baseado T ensaio de proliferação celular. Na ausência de MSC pulmão e presença de antigen células apresentadoras (APC) + / – ovalbumina (OVA) CD40 de células T efetoras positivos demonstram uma diminuição na intensidade CFSE que indica a proliferação (círculo vermelho). Intensidade de fluorescência CFSE da membrana da célula T diminui estequiometricamente com cada ou seja a divisão celular. em cada divisão. Na presença de pulmão MSC, APC + / – OVA, CD40 de células T efetoras positivos demonstram nenhuma mudança significativa na intensidade CFSE o que indica uma falta de proliferação (círculo vermelho).