Isolamento e caratterizzazione di Hoechst ^Basso CD45 ^Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

1. Isolamento del polmone Sacrificio topi adulti (8-10 settimane di età, 18-20 g; C57Bl6J) topi con una dose eccessiva di isoflurano seguito da dissanguamento con tecnica sterile. Profili varia leggermente tra i ceppi. Rimuovere chirurgicamente il diaframma, aprire la cavità toracica, tagliando la gabbia toracica laterale su ciascun lato del mouse. Lavare il sangue dai polmoni mediante perfusione del ventricolo destro del cuore delicatamente con 3-5mls di tampone fosfato (PBS). Sezionare i lobi polmonari rimuovendo trachea, i bronchi grandi e metterlo in una capsula di Petri riempite con soluzione salina tampone Hanks (HBSS). Seguente raccolta di tutte le pinze lobi polmonari sono utilizzati per posizionare il tessuto sul coperchio del piatto. Tessuto viene poi macinato in piccoli pezzi con bisturi monouso con abbastanza liquido per mantenerli umidi, ma non così tanto che galleggiare e muoversi. Sezionare uno degli arti posteriori di uno dei topi e isolare il midollo osseo da utilizzare come un controllo colorazione per impostare la flow citometria cancelli. Macchia del midollo osseo (BM), come descritto in precedenza 1. 2. Preparazione di una sospensione cellulare singola da tessuto polmonare Ogni polmone è digerito utilizzando un peso ottimizzato dei tessuti in rapporto al volume di 0,2 g: 5mls di pre-riscaldato 0,2% Worthington collagenasi di tipo 2 (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; cat # LS004202) disciolto in HBSS sterile. La miscela è immerso in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min 2,3. Triturare campione bene fino a digerire il tessuto polmonare scorre facilmente attraverso una pipetta da 10 ml (circa 10 ripetizioni). Incubare per altri 15 minuti a 37 ° C per completare il tessuto digerisce e assicura una sospensione più uniforme singola cellula. Diluire la sospensione cellulare del polmone con HBSS e triturare con una pipetta da 5 ml per disperdere frammenti di tessuto residuo. Filtrare la sospensione con un colino 70μM cellula per rimuovere frammenti di tessuto non digerito. Campione può essere diviso in multipltubi e conici, a questo punto per evitare di sovraccaricare uno colino cellula e diminuire il tempo. Pellet la sospensione cellulare per 10 min a 1500 giri e decantare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare delicatamente con temperatura ambiente RBC lisi buffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere un volume equivalente di HBSS di inattivare il tampone di lisi e filtrare la sospensione cellulare usando un colino 40μM cellula per rimuovere i detriti e aggregati cellulari. Pipettare 10μl di ciascun campione da colorare e contare il numero di cellule sia per il polmone e campioni di BM con un emocitometro. Nota: registrare il volume totale delle cellule. Pellet la sospensione cellulare di cellule polmonari mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min. Risospendere sia polmoni e le cellule BM a 1×10 6 cellule / ml in preriscaldata (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modificato Eagle medio, alto livello di glucosio (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) contenente il 2% Bovi fetalene siero (FBS) e HEPES 10mM. Preparare una soluzione 1mg/ml stock di Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) in acqua e filtro sterilizzare 1,4. Il colorante Hoechst può essere memorizzato come aliquote a -80 ° C. Aggiungi Hoescht 33342 colorante ad una concentrazione finale di 5μg/ml (a 200x diluizione di uno stock 1mg/ml) alla sospensione singola cella. Mescolare delicatamente le cellule inversione e incubare in bagnomaria a 37 ° C per esattamente 90 minuti. 3. Colorazione e Preparazione della sospensione di Polmone di Cellula per l'analisi Citometria a Flusso Dopo 90 minuti tutti i punti con le cellule polmonari Hoechst macchiato deve essere eseguito a 4 ° C o su ghiaccio per evitare efflusso colorante. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min a 4 ° C e risospendere le cellule in ghiaccio freddo colorazione tampone (PBS +2% FBS). Risospendere le cellule ad una concentrazione non superiore a 1×10 7 cellule / tubo utilizzando 300-600μl di PBS contenente il 2S e HEPES 10mM. Aggiungi adeguatamente ridacchiò anticorpo CD45 (di solito 1:200 diluizione di CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864), al polmone e campioni di BM Incubare in ghiaccio per 10-15 min Compreso un controllo senza macchia durante il.. procedura sperimentale è utile per impostare le porte di analisi. Cellule pellet a 4 ° C per 5 min a 1500 giri. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 500 ml di buffer di colorazione fredda (PBS +2% FBS). Trasferimento a tubi prechilled scatto tappo in polipropilene (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). Aggiungi ioduro di propidio (PI, fotografia 200μg/ml in PBS) per i campioni per una concentrazione finale di 2μg/ml di escludere le cellule morte. PI deve essere utilizzato in combinazione con il colorante Hoechst 33342 per ottenere il profilo corretto di fluorescenza su citometria a flusso. Conservare le provette su ghiaccio, al riparo dalla luce fino al momento dell'analisi in citometria a flusso. 4. Citometria a flusso di analisi per definire e isolareuno Stem Cell Lung mesenchimali (MSC polmone) Popolazione con tintura Hoechst efflusso di rilevare una popolazione Side (SP) Questo test ha lo strumento seguenti requisiti: 488 nm e UV (350-355 nm) 2 rivelatori sul cammino laser UV con il blu (450/65) e rosso (675/50) filtri. Il rilevatore UV rossi devono essere ad alta sensibilità per il segnale rosso. Questo può essere un problema con selezionatrici delle cellule vecchie. Impianto di refrigerazione per mantenere il campione a 5-10 ° C. Allineare i laser e configurare per l'ordinamento delle cellule seguendo il protocollo del produttore. Raccogliere il rosso (asse x) e blu (asse y) segnali Hoechst utilizzando una scala lineare. Regolare le tensioni del tubo fotomoltiplicatore per posizionare il picco G0/G1 in alto a destra del centro sul terreno per consentire un'adeguata visualizzazione della popolazione lato finale. Una parte della fase S e l'intero G2 del ciclo cellulare può essere fuori scala in alto a destra del grafico. L'azzurro firmasegnale è relativamente brillante, mentre il segnale rosso è scarsa. Tipico MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) tensioni sono 425 per il blu e 650 per il rosso. Le cellule morte vengono gated con l'ausilio di PI. Il percorso standard PI (eccitazione 488 nm, emissione di 630nm) possono essere utilizzati. In alternativa, PI è anche entusiasta dal laser UV e la popolazione di cellule morte è fuori scala sul lato destro della popolazione laterali (SP) trama. Questo riduce la necessità di compensare il segnale di PI da qualsiasi altra fluorocromi come FITC e PE. Il metodo originale Goodell seguito le ultime procedure 5-7. Mantenere una differenza di pressione relativamente bassa durante l'analisi e la selezione per assicurarsi della tenuta della popolazione laterali. La SP appare come un braccio di lato a parte la principale popolazione di cellule del polmone. Questa popolazione è chiamata Hoechst basso. Il basso Hoechst / SP viene analizzata per separare le popolazioni CD45 positivi e negativi utilizzando un istogramma 2,3 (FIGURA 1). A seguito di selezione e gating del basso Hoechst popolazione CD45 neg MSC polmone le cellule possono essere raccolte da ordinamento sia come popolazione mista in un tubo o di singole cellule per isolare cloni in una piastra a 96 pozzetti 3. Per piastra di smistamento del flusso di deflessione ordinamento è regolato al 25% per creare un flusso specie più verticale di quello solitamente usato per l'ordinamento del tubo. Dirigere il getto ordinare l'invio di un impulso di corrente di prova sulla parte superiore sinistra e poi in basso a destra e di una piastra a 96 pozzetti. Impostare il software mappa selezionatrice piastra per depositare il numero desiderato di cellule in ogni pozzetto. Per isolare cloni singola cella uno MSC polmone singolo è ordinato nel pozzo di una piastra a 96 pozzetti in 150μl di cultura dei media (α-MEM integrato con 20% FBS). Dopo l'ordinare un ulteriore 100μl di medium viene aggiunto. 5. Isolamento, coltura e caratterizzazione di polmone MSC e cloni Culture ed espansione della popolazione mista MSC polmone e cloni di cellule singole che seguono l'ordinamento è identico con condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% di CO 2 e umidità> 95%). Le cellule sono permesso di aderire isolamento seguenti per 16 ore. Media è sostituito ogni 48 ore (α-MEM integrato con 20% FBS). Quando le cellule iniziano a proliferare più rapidamente e raggiungere confluenza tra il 75-80% sono diversi passaggi (Figura 2). Le cellule sono sciacquati con HBSS preriscaldata e incubate con 0,5% tripsina / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) a 37 ° C per meno di 2 min. Le cellule sono monitorati utilizzando una portata invertita per confermare l'aspetto di una sospensione cellulare. Polmone MSC sono poi divisi con rapporti di 1:2 o 1:3 a seconda del tasso attuale proliferazione della cultura. La capacità di MSC polmone di differenziarsi in linee tradizionali mesenchimali di osteoblasti, adipociti e condrociti e la loro espressione sulla superficie cellulare dei accettato i marcatori mesenchimalis valutati per ogni preparazione cellulare. Analisi citogenetica bande è anche esibito per confermare l'assenza di gravi anomalie cromosomiche 2,3,8-11. 6. Enumerazione di MSC polmone usando un test formanti colonia (CFU-F) Diluire cellule in terreno MesenCult completa (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) ad una concentrazione finale di 1×10 6 cellule / ml. Eseguire diluizioni in serie per raggiungere concentrazioni finali in un piatto 100mm di 6×10 4 celle, 3×10 4 celle, 1,5 x10 4 celle e 0,75 x10 4 celle in 10 ml di media. Le analisi sono eseguite in triplicato duplicato o per ogni concentrazione cellulare e può essere scalato per superfici più piccole. Celle di coltura per 10 giorni in condizioni standard. Il giorno 10 celle vengono sciacquati con PBS e fissati con metanolo al 100% per 5 minuti a temperatura ambiente. Rilevare il CFU-F colonie con la colorazione 0,4% w / v soluzione colorante Giemsa(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diluito 1:20 con acqua deionizzata. Attendere che i campioni di aria secca e quantificare il numero di colonie contenenti più di 25 cellule per colonia (Figura 3). 7. Analisi delle proprietà immunomodulanti delle MSC polmone a cellule T proliferazione e apoptosi 6.25×10 4 celle polmonari MSC per pozzetto sono rivestiti in piastre da 96 pozzetti e lasciato riposare tutta la notte 2. Cellule CD4 + da milza di recettore delle cellule T (TCR) topi transgenici, OT-II con le cellule T che riconoscono il ovalbumina 323-339 peptide, sono purificati mediante deplezione CD8 +, CD19 +, MHC-II + e CD25 + con una cella Miltenyi AutoMACS sorter (Miltenyi, Auburn, CA). Cellule presentanti l'antigene (APC) sono isolati dal positivamente ordinamento MHC-II + cellule 12. APC sono fissate in 4% paraformaldeide, lavati 3 volte in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, e caricato con 0.5μg/ml o 5μg / ml OVA323 peptide. Simulata, la crescita arrestati APC vengono aggiunti alla MSC polmone in piastre da 96 pozzetti. Superiore al 95% pura CD4 + 1×10 5 cellule sono etichettati con 5 micron Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE, Sigma, St.Louis MO) in PBS e incubate per 5 minuti al buio, lavato con BSA PBS-5%, e poi aggiunti al APC e cellule MSC polmone in DMEM al 5% FBS media. Le cellule sono poi incubate per 96 ore. T-cellule sono poi colorati con anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) e analizzati utilizzando un Miltenyi MacsQuant 7 citofluorimetro canale (Miltenyi, Aurburn, CA) e flojo software di analisi (Treestar, Ashland, OR). Proliferazione è misurata come la diminuzione di intensità media di fluorescenza CFSE rispetto allo sfondo, le cellule T etichettati con CFSE e non esposto ad APC (Figura 4). T-cellule sono contate in questo momento e vitalità valutato con esclusione trypan blu. 8. Rappresentante dei risultati: <p class="Jove_content"> Figura 1. Analisi citofluorimetrica e definizione di MSC polmone. Sospensioni singola cellula del tessuto digerire polmone sono colorati con Hoechst 33342 e analizzati mediante citometria a flusso per rilevare le differenze in A. forward scatter (FSC) e lato dispersione (SSC) e B. Hoechst blu e rosso fluorescenza. La presenza di una popolazione laterale (SP) è visibile nel cancello. La Hoechst bassa SP viene poi analizzata per separare il C. Popolazione CD45 negativa di MSC polmone. Il CD45 positivo ai rapporti negativi di polmone SP sono di solito 70:30 / 60:40. Figura 2. Isolamento e la coltura di MSC polmone. Dopo la raccolta della MSC polmone di separazione delle cellule, le cellule sono placcati in piatti di 30 millimetri con α-MEM supplemented con il 20% FBS. A. Appena le cellule appaiono ordinati piccolo, rotondo e brillante. B. Dopo circa 2-3 settimane con colonie di un fenotipo mesenchimale diventano evidenti e la proliferazione è più evidente. Figura 3. Enumerazione di MSC da Colony Forming fibroblasto-saggio. Esteso polmone MSC sono placcati per il protocollo descritto per il saggio CFU-F. A. Dopo 10 giorni e colonie Giemsa sono evidenti. B. Le colonie sono grandi e composta da un poche centinaia di cellule. C. Le cellule visualizzare un fenotipo mesenchimale. A & B, bar Scala = 0,5 cm; bar Scala C = 0,14 cm. Figura 4. CFSE saggio basato su cellule T proliferazione. In assenza di MSC polmonari e la presenza di antigen cellule presentanti (APC) + / – ovalbumina (OVA) CD40 delle cellule T effettrici positivi dimostrano una diminuzione di intensità CFSE che indica la proliferazione (cerchio rosso). CFSE intensità di fluorescenza della membrana delle cellule T diminuisce stechiometricamente con tutti cioè la divisione cellulare. con ogni divisione. In presenza di MSC polmone, APC + / – OVA, CD40 delle cellule T effettrici positivo dimostrare nessuna variazione significativa in intensità CFSE che indica una mancanza di proliferazione (cerchio rosso).