識別のためのアレロタイプ化PCRサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌

1。 PCRテンプレートの調製 注：）1）テンプレート（DNA）準備、2 PCRのセットアップ、および3）ゲル電気泳動：PCRキャリーオーバーコンタミネーションを最小限にするためには、それはPCR互いに物理的に別のいくつかの重要なキーステップを保つことが重要です。また、ピペッターの文化や試薬の汚染を防ぐために障壁のヒントを使用することをお勧めします。 単一の孤立したコロニーから分離サルモネラとルリアベルターニ培養液または他の複合培地（ブレインハートインフュージョン、Superbroth、等）の1mlを接種する。 37℃で一晩培養液を、Cを滅菌済み、1.5 mlの容量のマイクロチューブに1 mlを、約2分間4500 × gで細菌の細胞懸濁液を遠心してください。細胞をペレット化する。 上清をデカントでは、10分間室温で100％エタノールとセットの1mlで細胞ペレットを再懸濁します。以前のように、細胞をペレット化する（4,500 × gで、2分。）、1mlのPBSで上清と再懸セルを削除する。 遠心細胞は（4,500 × gで、2分。）、無菌のdH 2 Oを1mlの上清と再懸セルを廃棄 -20のdH 2 O（5μl/95液のdH 2 O）と店舗℃で、最終的な細胞懸濁液1 / 20希釈する-20℃でPCRの鋳型として全細胞の貯蔵寿命は約1ヶ月です。 2。 PCRセットアップ 注：PCR反応ミックスの調製と調剤（テンプレート、バッファ、oligonucletoideprimers、ヌクレオチドおよびTaq DNAポリメラーゼ）は、PCR / UVワークステーションに専用の、好ましくは行わ物理的に別々の部屋で実行する必要があります。 注：PCRは、部屋もPCR試薬（緩衝液、オリゴヌクレオチドプライマー、及びヌクレオチド）、酵素とテンプレート、PCRのセットアップに設定された専用のピペッターの保管用に指定された-20℃フリーザー、使い捨てのゴム手袋で自己完結型である必要があります設定、白衣、バリアのヒント、マイクロタイタープレート、ガラスキャピラリー、マイクロチューブ、および除染面の10％の漂白剤。 PCRの試薬を分注するために、専用のピペッターセット（P10、P100、およびP1000）を使用してください。このピペットセットには、セットアップのワークステーションを離れることは、ありません。 注意：分子生物学またはPCRグレードのdH 2 O、アリコートを1.5 ml容量の遠心チューブに1 mlを取得。交差汚染をできるだけ回避するために、各使用後は小分けのdH 2 Oを分注する。同様のアプローチは、他のPCR試薬とを推奨します。 注意：UV照射及び/又は10％漂白剤で表面を拭くと、使用前にワークエリアを除染。 PCRのセットアップを実行する際に白衣とゴム手袋を着用してください。前後にPCRからのトラフィックを最小限に抑えるためのPCR反応をthermocylcerとPCR産物（アンプリコン）アガロースゲル上で分離されている中でインキュベートされている領域にセットアップ。あなたがPCRのセットアップエリアに戻っている場合、あなたが現在着用し、手袋の新しいペアに置かれているラテックス手袋処分する。 5 × 10 -4 Mの濃度にのdH 2 Oでマスタープライマーの在庫を確認1月20日のdH 2 O（; 25μM5μl/95液のdH 2 O）のプライマーを希釈する。各フラジェリンタイピングプライマー用オリゴヌクレオチド配列は、表1に記載されています。 -20℃の冷凍庫からPCRの試薬およびテンプレートを取得し、試薬とサンプルが氷上で解凍することができます。必要になるまで冷凍庫にTaq DNAポリメラーゼを残す。 表1に示すようにアレロタイプ化PCR反応ミックスのための試薬を分注する。 列（例えばA1）の上部から始まり、次の先頭に列を下に移動し、滅菌、96ウェル、ポリスチレンマイクロタイタープレートで10丸底の各ウエルに、PCR反応ミックスの9μlを分注する。 ポジティブコントロールのテンプレート（I / G、Mタイピングプライマー-ネズミチフス菌及びサルモネラの0.5μl、最初のウェル（A1）にPCRミックスを9μL（無DNAの制御）へのdH 2 Oを1μlを追加します。r/z10タイピングプライマー-ハイデルベルクとハダル、及び1,2 / E、N、Xタイピングプライマー-ネズミチフス菌とハダル）も2回目のPCRミックス（B1）9μlに、および大腸菌の1μLにK12DH5α第3のウェルにPCRミックスを9mlの（C1）。 各追加も（D1 – H1、A2、B2）の場合は、PCR反応ミックス中、第9μlに解凍したサンプルテンプレートを1μl加える。 I / G、Mアレロタイプ化PCR、S.用enterica血清型ネズミチフス菌（i）とEnteritidisは（G、M）はポジティブコントロールとして機能し、 サルモネラ血清型ハイデルベルク（R）とハダル（Z10）はR / Z 10アレロタイプ化マルチプレックスPCRのポジティブコントロールです。 アイダホテクノロジーRapidcycler（8）の指定ホルダーに10μlの容量ガラスキャピラリーを置きます。 かつてホルダーに固定、にキャピラリーに触れてPCR反応ミックスとキャピラリー各ガラスをロードするマイクロタイタープレートの底の井戸。液体がチューブを下に移動して終了し、熱が毛細血管の両端を密封するためにブタンのトーチでガラス管を密封する前にPCRミックスの間にスペースを提供できるようにホルダーを傾け。 アイダホテクノロジーRapidcyclerにキャピラリーチューブとホルダーを配置し、PCRを実行するために、異なるアレロタイプ化プライマーについては表1に記載のサーマルサイクラーのプログラムを使用してください。 クラーのプログラムが完了すると、ゲル電気泳動のステップに進みます。 3。ゲル電気泳動 注：電気泳動の研究室と使い捨てゴム手袋の新しいペアで使用するために指定された別の白衣を着用してください。 注：UV保護めがねゴーグルまたはフェイスシールドを着用し、エチジウムブロマイド、特にアガロースゲルを取り扱う際は常に手袋だった。 繰り返し周期的な視覚を持つ2〜5分間間隔の20％の電力で設定されたマイクロ波でアガロース懸濁液を加熱することにより1xTAE（または1 × TBE）電気泳動緩衝液（7）における分子生物学グレードのアガロース100ミリリットル溶融1.5％（w / v）の準備点検。それは、水浴の温度に平衡化するまで60 ° Cの水浴中で溶融アガロースを設定します。 溶融アガロースを注ぐ前にくしでゲルの金型を設定します。十分なコントロールのための井戸、サンプル、およびその両端に配置し、アガロースゲルの中央のために少なくとも3分子量標準を生成するのに十分な歯を持つゲルのコームを選択してください。 、混ぜ気泡を製作するのを避けるため、ゆっくりと瓶の中身を注ぐことに優しくスワールボトル、1xTAEで溶融1.5％（w / v）アガロース（またはTBE）100mlにエチジウムブロマイド（10 mg / ml）を2μlを添加する10センチメートルアガロースゲルで15のためのゲル型の真ん中に。アガロースゲル内の任意の気泡を除去するためにティッシュペーパーやペーパータオルのエッジを使用してください。 アガロース固化（〜30〜45分）まで、室温で設定されたゲルの金型をしてみましょう。潜水艇、1X TAE（または1 × TBE）電気泳動用バッファーを含む水平電気泳動槽にゲル＆コーム付ゲルトレイを転送します。ゆっくりとアガロースゲルからコームを抜き取る。 このポールは、ゲルの下部にかどうかを確認して電気泳動槽の陰極または陽極からの相対ゲルトレイの配置を確認してください。注：陰極に向かって負に荷電したDNA移行する（すなわち、"赤に実行する"）を覚えておいてください。 6X DNAのローディング色素を40μlとしたDNA分子量マーカー（0.25μg/μLの）のプレミックス200μlの。最初、真ん中、最後のウェルに予備混合したDNA分子量マーカーXIVの4.8μlをロードします。 左から右に移動し、よく2から始まると後続の各ウェルに進んでPCRサンプルのそれぞれをロードします。分子量標準を含むウェルのいずれかでサンプルをロードしないように。 キャピラリー各ガラスに含まれるサンプルをロードするには： そのホルダーとエッチングからガラスカッターとキャピラリーの両端をそれぞれのキャピラリを取り外します。 キャピラリーの両側に両手の親指と人差し指は、ガラスカッターでマークされ、毛細血管をはめ込みます。 PCR反応ミックスの端の反対側にキャピラリーディスペンサーを置き、ゆっくりと液体がチューブの一番下になるまで時計回りにプランジャーを回す。 ロードされるようにウェルにキャピラリーを置き、ゆっくりよくアガロースにフィコール加重サンプルを分注するために時計回りにプランジャーを回す。キャピラリーともしない穿刺に注意してくださいまたは液体の最後は、毛細血管を離れるときに、過去あまり回して、ウェルに気泡を導入する。 一度すべてのサンプルと標準がロードされ、90 V（9ボルト/ cmのアガロースゲル）への電源の定電圧を設定します。 黄色の色素（Taurazine）フロントがゲルの底から1cmになると、電気泳動を中止してください。 電気泳動が完了すると、DNA断片と分子量標準を可視化するためにUVトランスにゲルを移す。またはサーマルプリンタとCCDカメラと印刷イメージを使用してデジタル画像として：オレンジ色ガラスフィルター（2 ×、4.5 yを設定）でポラロイドカメラを使用して、ポラロイドフィルム上にイメージをキャプチャします。 15〜30分間10％の漂白剤のキャピラリーホルダーを置きます。のdH 2 OおよびバックPCRセットアップの室内の空気乾燥の場所で3回リンス。 4。代表的なマルチプレックスPCRの結果 1から10までのサルモネラ分離株のアレロタイプ化PCRの結果を図1に示す（レーン3-12）と次のように解釈されます。 O対立遺伝子の指定は、PCRのコントロールにサイズに一致するとは、Oの対立遺伝子のプライマーに対して予測アンプリコン（PCR産物）に基づいて分離サルモネラに与えられる（3）使用する設定：B – 560bp、C1 – 340bp、C2 – 400bpの、 D1 – 620、BP、およびE1 – 280 BP。 – Oアレロタイプ化PCR（図1A）でテスト分離株の場合、我々は（レーン10 B Oの対立遺伝子を割り当てレーン3-12にテストされたサルモネラが分離さ10〜13）、C1（レーン7-9）、C2（レーン4,5）、D1（レーン3）、およびE1（レーン6）。これらの同一のサルモネラ菌分離株は 、図と同じ順序で、テストされました。 1A、H1の対立遺伝子のi、G、M、R、およびz10（図1B、C）。再び、H1の対立遺伝子は、それぞれのPCRのコントロールにサイズに一致するアンプリコンの存在に依存して分離するために割り当てられ、など（3）使用される4 H1の対立遺伝子のプライマーを設定するための予測：I – 510 BP（図1B、レーン2 ）、G、M – 310 BP（図1B、レーン2）、​​R – 170 BP（図1C、レーン2）、​​およびz10 – 360 BP（図1C、レーン2）。 H1の対立遺伝子は10個のサルモネラ分離株のいずれかに割り当てられていた：私は- 3と8を（図1B、レーン5＆10）隔離し、G、M -分離株1および5（図1B、レーン3＆7）、Rに分離株6と9（図1C、レーン8＆11）;。分離株2、7、および10（図1C、レーン4、9、および12）へとz10のサルモネラが分離4は、テストした4 H1の対立遺伝子は陰性であった。最後に、 サルモネラの分離株は、1,2に関連付けられているH2の対立遺伝子についてPCRにより試験した、1,5、1,6、1,7抗原複合体とE、N、X、E、N、Z15抗原複合体。 1,6、、1,5、1,7、複雑にし、H2 E、N、X、プライマーは、H2 1,2については設定のe、nは、Z15複合体（3）はそれぞれ、290 bpおよび150 bpのアンプリコンを生成する。プライマーセットは、決定的な対立遺伝子の種類、元を割り当てるには、どちらかH2の抗原複合体に含まれる特定のH2の対立遺伝子を区別することはできません。 。分離するために1,2、（3） サルモネラ4を分離し、6、8-10 H2 1,2に関連付けられているH2の対立遺伝子が陽性であった、1,5、1,6、1,7抗原複合体、分離株2としながらE、N、Z15抗原複合体（データは示さず）、7は、e、nは、xに関連付けられたH2の対立遺伝子が陽性であった。 サルモネラは 1,3、および5二つH2抗原の複合体は陰性であった分離しながら、唯一の1と5は、H2フラジェリンのためのような一般的なH2フラジェリンPCR（1）（データは示さない）を用いて決定陰 ​​性であった分離します。これらの結果は、各分離するために割り当てられていると推定されるサルモネラの血清型と一緒に表2にまとめた。 図1。 S.に関連付けられた特定のOとHの対立遺伝子を識別するためのマルチプレックスPCR enterica血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス。（）O対立遺伝子のマルチプレックスPCR。 I / G、M（B）とr/z10（C）：フラジェリンの対立遺伝子を識別するための（B、C）H1アレルマルチプレックスPCR。レーン1と13：100 bpのラダー（プロメガ社、マディソン、WI）、レーン2：マルチプレックスPCRのコントロールO対立遺伝子B、C1、C2、D1、およびE（）のため、H1の対立遺伝子I / G、M（B）、およびH1は対立遺伝子r/z10（C）、およびレーン3-12： サルモネラは、1〜10（表2）を分離します。 PCRマスターミックス サーモ（Rapidcycler） 試薬 コンポジション/濃度 量は   パラメータ 予想されるサイズ H1 I / G、M のdH 2 O 63μlのプログラム1 94℃で1分間 10 × PCRバッファー 20mMのMgCl 2の 10μlのプログラム2 1秒94 ° C 500 mMTris PH8 1秒、55 ° C 2.5 mg / mlのBSA 20秒72 ° C 5パーセントフィコール400 40サイクル 10 mMTartrazine 傾き= 2.0 プライマーI（F）* AACGAAATCAACAACAACCTGC 2μlのプログラム3 4分間72℃ 510 bpのプライマーI（R）* TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2μlのプライマーG、M（F）* GCAGCAGCACCGGATAAAG 2μlの 310 bpのプライマーG、M（R）* CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2μlの DMSO 5μlののdNTP 10 mMの 2μlの Taqポリメラーゼ 5単位/μlの 2μlの 90μlの H1 R / Z 10 のdH 2 O 55μlのプログラム1 94℃で1分間 10 × PCRバッファー 30mMのMgCl 2の 10μlのプログラム2 1秒94 ° C 500 mMTris PH8 1秒、55 ° C 2.5 mg / mlのBSA 20秒72 ° C 5パーセントフィコール400 40サイクル 10 mMTartrazine 傾き= 2.0 プライマーR（F）* CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl プログラム3 4分間72℃ 170 bpのプライマーR（R）* GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl プライマーZ 10（F）* GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 bpのプライマーZ 10（R）* GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl DMSO 5μlののdNTP 10 mMの 2μlの Taqポリメラーゼ 5単位/μlの 2μlの 90μlの PCRマスターミックス サーモ（Rapidcycler） 試薬 コンポジション/濃度 量は   パラメータ 予想されるサイズ H2 1,2 / E、N、X のdH 2 O 63.6μL プログラム1 94℃で1分間 10 × PCRバッファー 20mMのMgCl 2の 10μlのプログラム2 1秒94 ° C 500 mMTris PH8 1秒、55 ° C 2.5 mg / mlのBSA 20秒72 ° C 5パーセントフィコール400 40サイクル 10 mMTartrazine 傾き= 2.0 プライマー1,2（F）* AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2μlのプログラム3 4分間72℃ 290 bpのプライマー1,2（R）* ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2μlのプライマーE、N、X（F）* TAACTGGCGATACATTGACTG 2μlの 150 bpのプライマーE、N、X（R）1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2μlの DMSO 5μlののdNTP 10 mMの 2μlの Taqポリメラーゼ 5単位/μlの 2μlの 90μlの一般的なH2 のdH 2 O 72μlのプログラム1 94℃で1分間 10 × PCRバッファー 30mMのMgCl 2の 10μlのプログラム2 10秒94 ° C 500 mMTris PH8 10秒45 ° C 2.5 mg / mlのBSA 35 S 72 ° C 5パーセントフィコール400 40サイクル 10 mMTartrazine 傾き= 2.0 プライマーfljB（F）* CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2μlのプログラム3 4分間72℃ 1500 bpのプライマーfljB（R）* TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2μlののdNTP 10 mMの 2μlの Taqポリメラーゼ 5単位/μlの 2μlの 90μlの 表1。 サルモネラ flagellinallelotyping PCR用プロトコール：合成、条件、および期待される結果。 * PCRオリゴヌクレオチドプライマーの作業用ストック濃度は25μMです。 隔離する Oのアレル H1のアレル H2のアレル 血清型   B C1 C2 D1 E 私 G、M R Z10 1,2、1,5、1,6、1,7 E、N、X、E、N、Z15 汎用の1   1 – – – + – – + – – – – – 腸炎 2 – – + – – – – – + – + + ハダル/イスタンブール3 3 – – + – – + – – – – – + ケンタッキー州 4 – – – – + – – – – + – + 未知 5 – + – – – – + – – – – – モンテビデオ 6 – + – – – – – + – + – + Infantisまたはウィルヒョウ2 7 – + – – – – – – + – + + ムバンダカ 8 + – – – – + – – – + – + ネズミチフス菌 9 + – – – – – – + – + – </td> + ハイデルベルク 10 + – – – – – – – + + – + ハイファ 表2。アレロタイプ化PCRの結果（図1）とサルモネラ血清型の指定は、O、H1、およびH2の対立遺伝子の同定に基づいて > 1 H2 PCRは関係なく、H2の対立遺伝子（1）の、H2フラジェリンを有するすべてのサルモネラは1.5 kbのターゲットを生成します。このPCRは、二相性のサルモネラの単相性を区別するために使用されます。 1,5; 1,6、1,7抗原複合体（3）2 H2マルチプレックスPCRは、H2 1,2の異なる対立遺伝子を区別できません。 S. 3ファージ変換血清型イスタンブールを生成するためにenterica血清型ハダルを変化させるLPS O抗原。 Oアレロタイプ化PCRは、これらの微妙な遺伝子/抗原性の変化を見分けることができません。 血清型1 Oのアレル H1のアレル H2のアレル   B C1 C2 D1 E 私 G、M R Z10 1,2、1,5、1,6、1,7 E、N、X、E、N、Z15 一般的な2 カリフォルニア州 + – – – – – + – – – – – ネズミチフス菌 + – – – – + – – – + – + ハイデルベルク + – – – – – – + – + – + ハイファ + – – – – – – – + + – + モンテビデオ – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – アシナイ – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + ムバンダカ – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + ケンタッキー州 – – + – – + – – – – – + ハダル/イスタンブール3 – – + – – – – – + – + + 腸炎 – – – + – – + – – – – – スレンバン – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + ロメ – – – + – – – + – – – + ポートランド – – – + – – – – + + – + ルアンダ – – – + – – – – + – + + トレギエ – – – + – – – – + – – + シミ – – – – + – – + – – + + ヴェルテフレーデン – – – – + – – + – – – + クリスチャンスタッド – – – – + – – – + – + + ビアフラ共和国 – – – – + – – – + – – + アレロタイプ化PCRにより同定された表3。 サルモネラの血清型 1太字で強調表示された血清型は、より一般的な診断や食品微生物学研究室で遭遇するものです。 2 H2 PCRは関係なく、H2の対立遺伝子（1）の、H2フラジェリンを有するすべてのサルモネラは1.5 kbのターゲットを生成します。このPCRは、二相性のサルモネラの単相性を区別するために使用されます。 S. 3ファージ変換血清型イスタンブールを生成するためにenterica血清型ハダルを変化させるLPS O抗原。 Oアレロタイプ化PCRは、これらの微妙な遺伝子/抗原性の変化を見分けることができません。