Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

1. הכנת תבנית ה-PCR הערה: על מנת למזער את זיהום PCR שריד, חשוב לשמור על מספר צעדים מפתח חשוב PCR פיזית, נפרדים זה מזה: הכנה 1) תבנית (DNA), 2) הגדרת ה-PCR, ו – 3) ג'ל אלקטרופורזה. מומלץ גם להשתמש טיפים מחסום כדי למנוע התרבות או מגיב זיהום pipetters. לחסן 1 מ"ל של לוריא Bertani מרק או בינוני מורכבות אחרות (עירוי הלב והמוח, Superbroth, וכו ') עם סלמונלה לבודד מהמושבה מבודד אחד. דגירה תרבות בין לילה ב 37 ° C. העברת 1 מ"ל ל סטרילית, 1.5 צינור microfuge מ"ל כושר, צנטריפוגה ההשעיה תא החיידק XG ב 4500 2 דקות ~. לתאי גלולה. למזוג supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של אתנול 100% ולהגדיר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. תאים גלולה כמו קודם (4500 XG, 2 דקות.), להסיר את התאים supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל PBS. תאים צנטריפוגה (4500 XG, 2 דקות.) להשליך תאים supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל סטרילי של DH 2 O. לדלל את ההשעיה התא הסופי 1 / 20 ב DH 2 O (5 μl/95 μl DH 2 O) ולאחסן ב -20 ° C. חיי המדף של תאים שלמים כתבנית PCR ב -20 ° C הוא כ חודש. 2. הגדרת ה-PCR הערה: הכנה מחלק של תערובת התגובה PCR (תבנית מאגרים, oligonucletoideprimers, נוקלאוטידים ו-DNA פולימראז תקי) צריך להתבצע בחדר נפרד פיזית ייעודי נעשה רצוי עבודה PCR / UV. הערה: PCR הקימו חדר חייב גם להיות עצמאי עם מקפיא המיועד -20 ° C לאחסון PCR ריאגנטים (מאגרים, primers oligonucleotide, ו נוקלאוטידים), אנזימים תבנית, pipetter ייעודי להגדיר עבור ההתקנה PCR, כפפות גומי חד פעמיות , מעיל מעבדה, טיפים מחסום, microtiter צלחות זכוכית, נימים, צינורות microfuge ו אקונומיקה 10% משטחי decontaminating. השתמש סט pipetter ייעודי (P10, P100, P1000 ו) לוותר ריאגנטים PCR. זו קבוצה פיפטה אסור לעזוב את תחנת העבודה הגדרת. הערה: לקבל או ביולוגיה מולקולרית PCR כיתה DH 2 O ו aliquot 1 מ"ל לתוך צינורות קיבולת 1.5 מ"ל צנטריפוגות. לוותר aliquoted DH 2 O לאחר כל שימוש, כדי למנוע זיהום אפשרי צולבות. גישה דומה מומלץ עם חומרים כימיים אחרים PCR. הערה: לטהר את אזור העבודה לפני השימוש עם תאורה UV ו / או לנגב את המשטחים עם אקונומיקה 10%. ללבוש מעיל מעבדה וכפפות לטקס בביצוע ההתקנה PCR. מזעור הלוך ושוב תנועה PCR הגדרת לאזורים שבהם התגובות PCR מודגרת ב thermocylcer ומוצרים PCR (amplicons) מופרדים על agarose ג'לים. אם לחזור לאזור PCR הגדרת, להיפטר זוג של כפפות לטקס שהנך לובש לשים על זוג חדש של כפפות. ביצוע פריימר מאסטר המניות DH 2 o ריכוז של 5×10 מ -4 לדלל את primers 1 / 20 ב DH 2 O (5 μl/95 μl DH 2 o; 25 מיקרומטר). רצף oligonucleotide עבור כל צבע יסוד הקלדה flagellin מתואר בטבלה 1. אחזר ריאגנטים PCR ותבנית מהמקפיא -20 ° C, ולאפשר ריאגנטים דגימות להפשיר את הקרח. השאירו את פולימראז ה-DNA תקי במקפיא עד הצורך. לוותר ריאגנטים עבור לערבב PCR התגובה allelotyping כפי שמתואר בטבלה 1. לוותר 9μl של תערובת התגובה PCR לתוך כל אחד 10 בארות תחתית עגולה צלחת microtiter סטרילי, 96, טוב, קלקר, החל בראש העמודה (למשל A1) ולעבור את הטור לראש הבא. הוסף 1 μl של DH 2 O ל μl 9 של ה-PCR לערבב (אין שליטה DNA) לבאר הראשון (A1), 0.5μl של תבניות בקרה חיובית (i / g, מ הקלדה primers ו-Typhimurium enteritidis; r/z10 הקלדת primers-היידלברג הדר; 1,2 ו / e, n, x-הקלדה primers Typhimurium והדר) כדי μl 9 תמהיל PCR ב 2 nd היטב (B1), ו – 1 μl של Escherichia coli K12 DH5α ל 9 מ"ל של תערובת PCR בבאר השלישית (C1). גם עבור כל אחד נוסף (D1-H1, A2, B2), להוסיף 1 μl של תבנית מדגם מופשר ל μl 9 של תערובת התגובה PCR. עבור i / g, מ allelotyping PCR, ש enterica serovar Typhimurium (i) enteritidis (ז, מ ') לשמש שולטת חיובית, סלמונלה serovars היידלברג (r) והדר (Z10) הם שולטת חיובית עבור r / z 10 multiplex allelotyping PCR. מקום 10 μl קיבולת זכוכית לתוך הנימים בעלי המיועד טכנולוגיה איידהו Rapidcycler (8). מאובטח פעם בעל, לטעון כל נימי זכוכית עם תערובת התגובה PCR ידי נגיעה נימי אלבארות התחתון של הצלחת microtiter. הטה את המחזיק כדי לאפשר לנוזל לעבור את הצינור לספק רווח בין הקצוות תמהיל PCR לפני החום איטום צינורות זכוכית עם פנס בוטאן לאטום את שני הקצוות של הנימים. מניחים את צינורות נימי מחזיק לתוך טכנולוגיה איידהו Rapidcycler ולהשתמש תוכניות thermocycler המתואר בטבלה 1 עבור primers allelotyping שונים כדי להפעיל את ה-PCR. המשיכו לשלב ג'ל אלקטרופורזה כאשר תוכנית thermocycler הושלמה. 3. ג'ל אלקטרופורזה הערה: יש ללבוש חלוק מעבדה שונים המיועדים לשימוש במעבדה אלקטרופורזה ו זוג חדש של כפפות גומי חד פעמיות. הערה: יש ללבוש משקפי מגן UV לעין מגן או מגן פנים ותמיד היו כפפות בעת הטיפול ברומיד ethidium, במיוחד ג'לים agarose. הכן 100 מ"ל מותכת 1.5% (w / v) ביולוגיה מולקולרית כיתה ב agarose 1xTAE (או 1X TBE) חיץ אלקטרופורזה (7) שוב ושוב על ידי חימום במיקרוגל ההשעיה agarose מערכת בהספק 20% מרווחי 2-5 דקות עם ראייה תקופתיות בדיקה. הגדר את agarose מותכת באמבט מים C ° 60 עד equilibrates את הטמפרטורה של המים באמבטיה. הגדרת תבנית ג'ל במסרק לפני מזיגת agarose מותכת. בחר מסרק עם שיניים ג'ל מספיק כדי לייצר בארות מספיק שולטת, דוגמאות, ולפחות 3 תקנים משקל מולקולרי עבור המיקומים שלהם בקצוות באמצע הג'ל agarose. הוסף 2 μl של ethidium ברומיד (10 מ"ג / מ"ל) עד ​​100 מ"ל של מותך 1.5% (w / v) agarose ב 1xTAE (או TBE), בעדינות בקבוק מערבולת לערבב, להימנע לייצר בועות, בעדינות לשפוך את תכולת הבקבוק למרכז התבנית ג'ל על 15 על 10 ס"מ agarose ג'ל. השתמש קצה של נייר או מגבת נייר כדי להסיר בועות הג'ל agarose. תן עובש ג'ל להגדיר בטמפרטורת החדר עד agarose מבצרת (~ 30-45 דקות). מעבירים את המגש עם ג'ל ג'ל & המסרק הצוללת, תא אלקטרופורזה אופקי המכיל 1X טה (או 1X TBE) חיץ אלקטרופורזה. בעדינות להסיר את המסרק של הג'ל agarose. בדוק את המיקום של המגש ג'ל יחסית הקתודה או הקוטב החיובי של החדר אלקטרופורזה כדי להיות בטוח מוט זה בחלק התחתון של הג'ל. הערה: זכרו את ה-DNA מטען שלילי נודד לכיוון הקתודה (כלומר, "לרוץ אדום"). Premix 200 μl של סמני דנ"א משקל מולקולרי (0.25 מיקרוגרם / μl) עם 40 μl של דיי DNA 6X טוען. טען 4.8 μl של ה-DNA מעורבבים מראש מולקולרית משקל דה מרקר XIV אל, בארות first האמצעי האחרון. טען כל אחד מתחיל עם דגימות ה-PCR גם 2 וגם להתקדם היטב כל הבאים, נע משמאל לימין. הימנע טעינת המדגם בכל אחד בארות המכיל את תקן משקל מולקולרי. כדי לטעון דוגמאות הכלול זכוכית בכל נימי: הסר כל נימי מבעל שלה לחרוט בשני הקצוות של נימי עם חותך זכוכית. המקום האגודל והאצבע של שתי הידיים משני צדדיו של נימי בסימן חותך את הכוס להצמיד את נימי. מניחים את מנפק על נימי מול סוף לערבב את תגובת ה-PCR ולאט לאט להפוך את הבוכנה עם כיוון השעון עד נוזלי הוא בתחתית של התחתית. מניחים את נימי לבאר להיות טעון ולאט לאט להפוך את הבוכנה בכיוון השעון לוותר המדגם Ficoll משוקלל לתוך agarose היטב. להיזהר לא לנקב את היטב עם נימי או להציג את בועת אוויר לתוך הבאר על ידי הפיכת גם בעבר הרבה כאשר האחרון של הנוזל עוזב את נימי. לאחר כל דגימות סטנדרטים נטענים, להגדיר את מתח קבוע של אספקת החשמל ל 90 V (9 וולט / ס"מ agarose ג'ל). הפסק אלקטרופורזה פעם הצהוב צבע (Taurazine) הקדמי הוא 1 ס"מ מהחלק התחתון של הג'ל. לאחר אלקטרופורזה הושלמה, להעביר את הג'ל על transilluminator UV לדמיין שברי דנ"א תקן משקל מולקולרי. לכידת תמונה על סרט פולארויד באמצעות מצלמת פולארויד עם כתום זכוכית המסנן (הגדרות: 2 x, y ו – 4.5) או כדימוי דיגיטלי באמצעות מצלמה CCD ותמונה להדפיס עם מדפסת תרמית. מניחים את מחזיקי נימי ב אקונומיקה 10% דק '15-30. לשטוף 3 פעמים עם DH 2 O ומקום שוב בחדר ההתקנה PCR לייבוש באוויר. 4. נציג Multiplex PCR תוצאות תוצאות עבור allelotyping PCR של סלמונלה מבודד 1-10 מוצגים באיור 1 (נתיבי 3-12) ופירשו כדלקמן. ייעוד האלל O ניתנת סלמונלה לבודד מבוסס על amplicon (מוצר PCR) התאמה בגודל לשלוט PCR וחזה כמו פריימר את האלל O קובע בשימוש (3): B-560bp, C1-340bp, C2-400 נ"ב, D1-620 נ"ב, ו-E1-280 נ"ב. עבור מבודד נבדק עם allelotyping O-PCR (איור 1 א), אנו מוקצה O אללים B (מסלולים 10 -13), C1 (מסלולים 7-9), C2 (נתיבי 4, 5), D1 (מסלול 3), ו – E1 (מסלול 6) עד סלמונלה עשר מבודד נבדק נתיבי 3-12. מבודד אלה סלמונלה אותו נבדקו, באותו סדר כמו איור. 1A, עבור אללים H1 i; גרם, מ '; r; ו Z10 (איור 1 ב', ג'). שוב, אלל H1 מוקצה לכל לבודד תלויה בנוכחות amplicon התאמת גודל לשלוט PCR ו כצפוי את פריימר 4 אלל H1 קובע בשימוש (3): i-510 נ"ב (איור 1B, מסלול 2 ;) ז, מ-310 נ"ב (איור 1B, נתיב 2); r-170 נ"ב (איור 1C, נתיב 2); ו Z10-360 נ"ב (איור 1C, מסלול 2). אללים H1 חולקו אחד מעשרת מבודד סלמונלה: i – מבודד 3 ו – 8 (איור 1B, נתיבי 5 & 10); g, m-1 ו -5 מבודד (איור 1B, נתיבים 3 & 7), r ל מבודד 6 ו -9 (איור 1C, נתיבי 8 & 11). ו Z10 עד 2 מבודד, 7, ו -10 (איור 1C, נתיבים 4, 9, & 12) סלמונלה לבודד 4 היה שלילי במשך ארבע אללים H1 שנבדקו. לבסוף, מבודד סלמונלה נבדקו על ידי ה-PCR עבור אללים H2 הקשורות 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 ו-e אנטיגן מורכב, n, x, e, n, z15 מורכב אנטיגן. פריימר מגדיר עבור H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 מורכבים H2 דואר, n, x, e, n, z15 לייצר מורכבות 290 נ"ב ו 150 amplicons נ"ב, בהתאמה (3). מגדיר פריימר אינה יכולה להבחין אללים ספציפיים בתוך H2 H2 או אנטיגן מורכב להקצות סוג אלל סופי, לשעבר. 1,2, כדי לבודד (3) סלמונלה מבודד 4, 6, 8-10 היו חיוביות עבור אללים H2 H2 הקשורות 1,2,. 1,5, 1,6, 1,7 מורכב אנטיגן, בעוד מבודד 2 ו 7 היו חיוביות עבור אללים H2 הקשורים הדואר, n, x, e, n, z15 מורכב אנטיגן (מידע לא מוצג). בעוד סלמונלה מבודד 1, 3 ו 5 היו שליליות עבור שני קומפלקסים אנטיגן H2, רק מבודדת 1 ו 5 היו שליליות עבור H2 flagellin, כפי שנקבע באמצעות כללי H2 flagellin PCR (1) (הנתונים לא מראים). תוצאות אלו מסוכמים בטבלה 2 יחד עם serovar סלמונלה משוערת המוקצה לכל לבודד. באיור 1. Multiplex PCR לזיהוי O ספציפיים אללים H הקשורים ס enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. (A) O אלל Multiplex PCR. (B, C) Multiplex H1 אלל PCR לזיהוי אללים Flagellin: i / g, מ '(B) r/z10 (C). Lanes 1and 13: 100 סולם נ"ב (Promega; במדיסון, וויסקונסין); מסלול 2: זמנית שולטת PCR עבור אללים O B, C1, C2, D1, ו-E (A), אללים H1 i / g, מ '(B) אללים H1 r/z10 (ג); ואת נתיבי 3-12: סלמונלה מבודד 10/01 (טבלה 2). PCR מאסטר מיקס Thermocycler (Rapidcycler) ריאגנטים הרכב / ריכוז כמות   פרמטרים צפוי גודל H1 i / g, מ ' DH 2 O 63 μl תוכנית 1 94 ° C עבור 1 דקות חיץ 10X-PCR 20 מ"מ MgCl 2 10 μl תוכנית 2 94 ° C עבור 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C עבור 1 s 2.5 מ"ג / מ"ל ​​BSA 72 מעלות של 20 5% Ficoll 400 במשך 40 מחזורים 10 mMTartrazine Slope = 2.0 פריימר i (f) * AACGAAATCAACAACAACCTGC 2 μl תוכנית 3 72 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות 510 נ"ב פריימר i (r) * TAGCCATCTTTACCAGTTCCC 2 μl פריימר גרם, מ (ו) * GCAGCAGCACCGGATAAAG 2 μl 310 נ"ב פריימר גרם, מ '(r) * CATTAACATCCGTCGCGCTAG 2 μl DMSO 5 μl dNTP 10 mM 2 μl תקי 5 יחידות / μl 2 μl 90 μl H1 r / z 10 DH 2 O 55 μl תוכנית 1 94 ° C עבור 1 דקות חיץ 10X-PCR 30 מ"מ MgCl 2 10 μl תוכנית 2 94 ° C עבור 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C עבור 1 s 2.5 מ"ג / מ"ל ​​BSA 72 מעלות של 20 5% Ficoll 400 במשך 40 מחזורים 10 mMTartrazine Slope = 2.0 פריימר r (f) * CCTGCTATTACTGGTGATC 4μl תוכנית 3 72 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות 170 נ"ב פריימר r (r) * GTTGAAGGGAAGCCAGCAG 4μl פריימר z 10 (ו) * GCACTGGCGTTACTCAATCTC 4μl 360 נ"ב פריימר z 10 (r) * GCATCAGCAATACCACTCGC 4μl DMSO 5 μl dNTP 10 mM 2 μl תקי 5 יחידות / μl 2 μl 90 μl PCR מאסטר מיקס Thermocycler (Rapidcycler) ריאגנטים הרכב / ריכוז כמות   פרמטרים צפוי גודל H2 1,2 / e, n, x DH 2 O 63.6 μl תוכנית 1 94 ° C עבור 1 דקות חיץ 10X-PCR 20 מ"מ MgCl 2 10 μl תוכנית 2 94 ° C עבור 1 s 500 mMTris pH8 55 ° C עבור 1 s 2.5 מ"ג / מ"ל ​​BSA 72 מעלות של 20 5% Ficoll 400 במשך 40 מחזורים 10 mMTartrazine Slope = 2.0 פריימר 1,2 (ו) * AGAAAGCGTATGATGTGAAA 2 μl תוכנית 3 72 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות 290 נ"ב פריימר 1,2 (r) * ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC 2 μl פריימר e, n, x (ו) * TAACTGGCGATACATTGACTG 2 μl 150 נ"ב פריימר e, n, x (r) 1 TAGCACCGAATGATACAGCC 2 μl DMSO 5 μl dNTP 10 mM 2 μl תקי 5 יחידות / μl 2 μl 90 μl Generic H2 DH 2 O 72 μl תוכנית 1 94 ° C עבור 1 דקות חיץ 10X-PCR 30 מ"מ MgCl 2 10 μl תוכנית 2 94 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות 500 mMTris pH8 45 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות 2.5 מ"ג / מ"ל ​​BSA 72 מעלות צלזיוס למשך 35 שניות 5% Ficoll 400 במשך 40 מחזורים 10 mMTartrazine Slope = 2.0 פריימר fljB (ו) * CAAGTAATCAACACTAACAGTC 2 μl תוכנית 3 72 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות 1500 bp פריימר fljB (r) * TTAACGTAACAGAGACAGCAC 2 μl dNTP 10 mM 2 μl תקי 5 יחידות / μl 2 μl 90 μl טבלה 1. פרוטוקול סלמונלה flagellinallelotyping PCR: הרכב, התנאים, ואת התוצאות הצפויות. * ריכוז המניות עבודה של primers PCR oligonucleotide הוא 25 מיקרומטר לבודד O אלל H1 אלל H2 אלל Serovar   ב C1 C2 D1 E אני ז, מ ' r Z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, z15 Generic 1   1 – – – + – – + – – – – – Enteritidis 2 – – + – – – – – + – + + הדר / איסטנבול 3 3 – – + – – + – – – – – + קנטאקי 4 – – – – + – – – – + – + לא ידוע 5 – + – – – – + – – – – – מונטווידאו 6 – + – – – – – + – + – + Infantis או וירצ'וב 2 7 – + – – – – – – + – + + מבאנדקה 8 + – – – – + – – – + – + Typhimurium 9 + – – – – – – + – + – </td> + היידלברג 10 + – – – – – – – + + – + חיפה טבלה 2. Allelotyping תוצאות PCR (איור 1) ואת הכינוי Serovar סלמונלה בהתבסס על זיהוי O, H1, H2 ו אללים > 1 H2 PCR מייצרת amplicon 1.5 kb סלמונלה עבור כל בעל H2 flagellin, ללא קשר אלל H2 (1). PCR זה משמש כדי להבדיל מן monophasic סלמונלה biphasic. 2 H2 זמנית PCR אינה יכולה להבחין בין אללים שונים עבור H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 מורכב אנטיגן (3). 3 phage המרה ש enterica serovar הדר משנה LPS O אנטיגן לייצר serovar באיסטנבול. Allelotyping O-PCR לא יכול להבחין בשינויים הללו עדין / antigenic גנטית. Serovar 1 O אלל H1 אלל H2 אלל   ב C1 C2 D1 E אני ז, מ ' r Z10 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 e, n, x, e, n, z15 Generic 2 קליפורניה + – – – – – + – – – – – Typhimurium + – – – – + – – – + – + היידלברג + – – – – – – + – + – + חיפה + – – – – – – – + + – + מונטווידאו – + – – – – + – – + – + Othmarschen – + – – – – + – – – – – Athinai – + – – – + – – – – + + Papuana – + – – – – – + – – + + מבאנדקה – + – – – – – – + – + + Chincol – – + – – – + – – – + + קנטאקי – – + – – + – – – – – + הדר / איסטנבול 3 – – + – – – – – + – + + Enteritidis – – – + – – + – – – – – Seremban – – – + – + – – – + – + Campinense – – – + – – – + – – + + לומה – – – + – – – + – – – + פורטלנד – – – + – – – – + + – + ברואנדה – – – + – – – – + – + + Treguier – – – + – – – – + – – + סימי – – – – + – – + – – + + Weltevreden – – – – + – – + – – – + בקריסטיאנסטאד – – – – + – – – + – + + ביאפרה – – – – + – – – + – – + 3. טבלת סלמונלה enterica Serovars מזוהה על ידי Allelotyping PCR 1 serovars מודגשת מודגש הם אלה נתקלים לעתים קרובות יותר על ידי אבחון או מזון מעבדה במיקרוביולוגיה. 2 H2 PCR מייצרת amplicon 1.5 kb סלמונלה עבור כל בעל H2 flagellin, ללא קשר אלל H2 (1). PCR זה משמש כדי להבדיל מן monophasic סלמונלה biphasic. 3 phage המרה ש enterica serovar הדר משנה LPS O אנטיגן לייצר serovar באיסטנבול. Allelotyping O-PCR לא יכול להבחין בשינויים הללו עדין / antigenic גנטית.