레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑
Summary
본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석 할 수 있습니다.
Abstract
억제 뉴런은 대뇌 피질의 기능에 중요한 수 있습니다. 그들은 전체 대뇌 피질의 neuronal 인구의 약 20 %를 구성하고 자세한 1-4의 immunochemical, 형태학, 그리고 생리 학적 특성에 따라 다양한 하위 유형으로 세분화 할 수 있습니다. 이전 연구 억제 뉴런의 개별 유형의 고유 특성에 대해 많은 발표했지만, 지역 회로 연결에 대한 지식은 아직 3,5,6 상대적으로 제한됩니다. 각 신경 세포의 기능이 대뇌 피질의 회로 내에서의 흥분성의 억제 신경과 입력에 의해 형성되는 감안할 때, 우리는 특정 억제 세포 유형에 대한지도 지역 회로 연결에 레이저 스캐닝 photostimulation (LSPS)를 사용하고 있습니다. 기존의 전기 자극 또는 glutamate 뒤를 자극에 비해 LSPS 개별적으로 기록 뉴런 3,7-9에 광범위한 매핑 및 지방 기능 입력의 정량 분석을 허용하는 독특한 장점이 있습니다. 레이저 사진glutamate의 uncaging을 통해 자극을 선택적으로 통과 또는 하위 박판 매핑 해상도를 보장 말초 수석의 axons을 활성화하지 않고 perisomatically 뉴런을 활성화한다. 넓은 지역 이상 많은 자극을 사이트에서 매핑 입력을위한 LSPS의 감도와 효율성은 잘 대뇌 피질의 회로 분석에 적합합니다.
여기 전체 세포 패치가 현지 억제 회로 매핑에 대한 클램핑과 함께 LSPS의 기술을 소개합니다. 특정 억제 세포 유형의 대상으로 녹음 대상 세포 유형의 일관성 샘플링 및 기록 된 세포 유형의 모호 식별 할 수 피질 3,10에 제한 억제 뉴런의 인구에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 유전자 변형 마우스의 사용에 의해 촉진 아르 . LSPS 매핑에 관해서는, 우리는 시스템 장비를 설명 실험 절차 및 데이터 수집을 설명하고, 마우스 기본 somatose의 회로 매핑 현재의 예nsory 피질. 저희 실험에서 도시, 갇힌 glutamate는 UV 레이저 광분해에 의해 뇌 슬라이스의 spatially 제한된 지역에서 활성화되어, 동시 전압 클램프 녹음 photostimulation-evoked 신경 반응을 검출 할 수 있습니다. 대상 신경 세포에 흥분성의 또는 억제하거나 신경 입력의지도는 잠재적 인 presynaptic 사이트의 수백을 촉진하기 위해 레이저 빔을 검색하여 생성됩니다. 따라서, LSPS 반복 실험을 통해 억제 뉴런의 특정 유형에 impinging 신경 입력의 상세지도를 건설 할 수 있습니다. 함께 촬영, photostimulation 기반 기술은 neuroscientists에게 지역의 대뇌 피질 회로의 기능 조직을 결정하기위한 강력한 도구를 제공합니다.
Protocol
Discussion
Photostimulation 기반의 매핑 기법을 효과적으로 대뇌 피질의 회로를 분석하는 적용되었습니다. 많은 다른 장소에서 presynaptic 뉴런의 클러스터 photostimulation과 postsynaptic 신경 세포의 동시 녹음이 흥분성의의 공간적 분포의 정량적 측정을 제공하기 때문에 전체 셀 녹음과 함께 레이저 스캐닝 photostimulation는 하나의 뉴런에 presynaptic 입력 소스의 판상 분포의 고해상도 매핑 할 수 있습니다 또는 억제 입?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원을 위해 트란 Huynh, 앤드류 산 안토니오 (San Antonio), 제리 린 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 DA023700 국립 연구소에 의해 기금 XX에 DA023700-04S1되었습니다
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) |
Solutions:
- Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3).
- Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose)
- Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).
Riferimenti
- Ascoli, G. A. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature. 9, 557-568 (2008).
- Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nature. 5, 793-807 (2004).
- Xu, X., Callaway, E. M. Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons. J Neurosci. 29, 70-85 (2009).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
- Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex. Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).
- Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation. J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin. J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).
- Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction. PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Cardin, J. A. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459, 663-667 (2009).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).
