Het in kaart brengen Remmende neuronale circuits door Laser Scanning fotostimulatie
Summary
Deze paper introduceert een benadering van het combineren van laser scanning fotostimulering met hele cel opnames in transgene muizen die GFP in beperkte remmende neuron populaties. De techniek maakt uitgebreide mapping en kwantitatieve analyse van lokale synaptische circuits specifieke remmende corticale neuronen.
Abstract
Remmende neuronen zijn cruciaal voor corticale functies. Zij omvatten ongeveer 20% van de gehele corticale neuronale populatie en kan verder worden onderverdeeld in verschillende subtypes gebaseerd op hun immunochemische, morfologische en fysiologische eigenschappen 1-4. Hoewel eerder onderzoek heeft veel onthuld over de intrinsieke eigenschappen van afzonderlijke soorten remmende neuronen, kennis over hun lokale circuit verbindingen is nog relatief beperkt 3,5,6. Gezien het feit dat elk individueel neuron de functie wordt gevormd door de exciterende en inhiberende synaptische input binnen corticale circuits, hebben we met behulp van laser scanning fotostimulatie (WAPZ) naar de kaart lokale circuit verbindingen met specifieke remmende celtypen. Vergeleken met conventionele elektrische stimulatie of glutamaat bladerdeeg stimulatie, WAPZ heeft unieke voordelen waardoor uitgebreide mapping en kwantitatieve analyse van de lokale functionele ingangen individueel geregistreerd neuronen 3,7-9. Laser fotostimulatie via de glutamaat uncaging activeert selectief neuronen perisomatically, zonder activering van axonen van doorgang of distale dendrieten, die een sub-laminaire mapping resolutie zorgt ervoor. De gevoeligheid en efficiëntie van WAPZ voor mapping inputs van vele plaatsen stimulatie over een groot gebied zijn goed geschikt voor corticale circuit analyse.
Hier introduceren we de techniek van WAPZ in combinatie met whole-cell patch clamping voor lokale remmende circuit in kaart brengen. Gerichte opnamen van specifieke remmende celtypen vergemakkelijkt door het gebruik van transgene muizen die groen fluorescent eiwit (GFP) in beperkte remmende neuron populaties in de cortex 3,10 Dat sluit bemonstering van de beoogde celtypes en ondubbelzinnige identificatie van de opgenomen celtypen kunnen . Zoals voor WAPZ in kaart brengen, schetsen we het systeem instrumentatie, beschrijven de experimentele procedure en data-acquisitie, en de huidige voorbeelden van circuit in kaart brengen in muis primaire somatosensory cortex. Zoals geïllustreerd in onze experimenten wordt opgesloten glutamaat geactiveerd in een ruimtelijk beperkte gebied van de hersenen slice door UV laser fotolyse, gelijktijdige voltage-clamp opnamen waarmee de aanwezigheid van fotostimulering opgewekte synaptische responsen. Kaarten van zowel stimulerende of remmende synaptische input aan de beoogde neuron worden gegenereerd door het scannen van de laserstraal honderden potentiële presynaptische locaties te stimuleren. Zo WAPZ maakt de bouw van gedetailleerde kaarten van synaptische input botsende op specifieke soorten remmende neuronen door middel van herhaalde experimenten. Tezamen de fotostimulering gebaseerde techniek biedt neurowetenschappers een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van de functionele organisatie van de lokale corticale circuits.
Protocol
Discussion
Fotostimulering-based mapping technieken ook werkelijk zijn toegepast voor het analyseren van corticale circuits. Laser scanning fotostimulering gecombineerd met hele cel opname maakt het mogelijk hoge resolutie in kaart brengen van laminaire verdeling van presynaptische ingangsbronnen om enkele neuronen, omdat de gelijktijdige opname van een postsynaptische neuron met fotostimulering van clusters van presynaptische neuronen op veel verschillende locaties biedt kwantitatieve maatregelen van de ruimtelijke verdeling van …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin voor hun technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health subsidies DA023700 en DA023700-04S1 tot XX
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) |
Solutions:
- Sucrose-containing artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for slice cutting (in mM: 85 NaCl, 75 sucrose, 2.5 KCl, 25 glucose, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 0.5 CaCl2, and 24 NaHCO3).
- Recording ACSF (in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, and 10 glucose)
- Electrode internal solution (in mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, and 10 phosphocreatine; pH 7.2, 300 mOsm).
Riferimenti
- Ascoli, G. A. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature. 9, 557-568 (2008).
- Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nature. 5, 793-807 (2004).
- Xu, X., Callaway, E. M. Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons. J Neurosci. 29, 70-85 (2009).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
- Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex. Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).
- Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation. J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).
- Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin. J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).
- Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction. PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Cardin, J. A. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459, 663-667 (2009).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).
