آلية التفاعل اللوني مسعور اختيار عمود للاستخدام في تنقية البروتين
Summary
ويقدم وسيلة لتحديد الآلية المناسبة اللوني تفاعل مسعور (HIC) وسائل الاعلام لاستخدامها في عملية تنقية البروتين. أسلوب يستخدم لاللوني السائل المتوسطة بما في ذلك الضغط نظام مزج العازلة الآلي، وحقن الديناميكية حلقة العينة، واختيار عمود متسلسلة، وتحليل متعدد الطول الموجي، وجمع الانقسام شطافة الكسر.
Abstract
وعلى النقيض من الأساليب الكروماتوجرافى أخرى لتنقية البروتينات (مثل هلام الترشيح، الألفة، والتبادل الأيوني)، مسعور اللوني تفاعل (HIC) يتطلب عادة تحديد التجريبية (ويشار إلى فحص أو "الكشافة") من أجل اختيار أنسب وسيلة الكروماتوغرافي لتنقية بروتين معين 1. الطريقة المعروضة هنا يصف هذا النهج آلية لاستطلاع للاعلامية الائتلاف المثلى لاستخدامها في تنقية البروتين.
التحالف الدولي للموئل يفصل البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى من المحللة الخام على أساس الاختلافات في hydrophobicity. مشابهة لاللوني تقارب (AC) والتبادل الأيوني اللوني (يتم خصم المبلغ المخصص)، الائتلاف قادر على التركيز على البروتين من اهتمام لأنها تقدم من خلال عملية الكروماتوغرافي. البروتينات الأنسب لتنقية من قبل التحالف الدولي للموئل وتشمل هذه المناطق مع سطح مسعور وقادرة على تحمل التعرض لتركيزات الأملاح الزائدة من الذخيرة م 2nium كبريتات ((NH 4) 2 SO 4). غالبا ما يتم اختيار التحالف الدولي للموئل كوسيلة من وسائل تنقية للبروتينات التي تفتقر إلى علامة الألفة، وغير مناسبة وبالتالي لميلان، وعندما يتم خصم المبلغ المخصص لم يقدم تنقية كاف. الأنصاف مسعور على سطح البروتين ربط مؤقتا ليجند غير القطبية بالإضافة إلى مصفوفة، خامل غير متحرك. التفاعل بين البروتين ويجند تعتمد اعتمادا كبيرا على تركيز الملح من المنطقة العازلة التي تتدفق من خلال العمود اللوني، مع تركيزات عالية الأيونية تعزيز التفاعل البروتين يجند وجعل بروتين ثابت (ملزمة أي داخل العمود) 2. كما انخفاض تركيز الملح، والتفاعل البروتين يجند تبدد، وبروتين يصبح مرة أخرى متنقلة وelutes من العمود. وسائل الاعلام الائتلاف عدة متاحة تجاريا في مخلوط مسبقا الأعمدة، كل واحد يحتوي على عدة من يغاندس مسعور (مثل S-بوتيل، بوتيل، الأوكتيل، وفينيل) عبر ربط في كثافة متفاوتة على حبات الاغاروز من المواصفاتIFIC قطرها 3. عمود الآلي الكشفية يسمح لنهج فعال لتحديد التي ينبغي استخدام وسائل الاعلام عن مستقبل التحالف الدولي للموئل، والتجارب التحسين أكثر شمولا وتنقية البروتين يعمل 4.
بروتين معين يتم تنقيتها هنا هو المؤتلف ببروتين أخضر (GFP)، ومع ذلك، يمكن تكييفها لنهج لتنقية البروتينات الأخرى مع واحد أو أكثر من المناطق سطح مسعور. GFP بمثابة بروتين نموذجا مفيدا، نظرا لاستقرارها، فريد ذروة امتصاص الضوء في 397 نانومتر، ومضان عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية 5. وقد أعدت المحللة البكتيرية التي تحتوي على نوع البرية GFP في منطقة عازلة عالية من الملح، وتحميلها في المتوسط DuoFlow بيو راد نظام الضغط اللوني السائل، وكثف إلى الأعمدة التي تحتوي على وسائل الاعلام HiTrap الائتلاف الائتلاف المختلفة. وكان مزال البروتين من الأعمدة وتحليلها بواسطة خط في وسائل الكشف عن مرحلة ما بعد التشغيل. مزج العازلة، ودينامية حقن حلقة العينة، والعقيد تسلسليزيادة umn اختيار، وتحليل متعدد الطول الموجي، وجمع جزء انقسام شطافة وظيفة للنظام واستنساخ المنهج التجريبي.
Protocol
Discussion
وقد أثبتت أساليب اللوني السائل لا يقدر بثمن لإعداد البروتينات عالي النقاء اللازمة لإجراء 6 المناعية، والكيمياء الحيوية 7، والهيكلية الدراسات 8. طرق تنقية الائتلاف غالبا ما تتطلب تحديد التجريبية من الوسيلة المفضلة، وهيكل يجند، كثافة يجند، وخصائص كل حبة مصفوفة وقد ثبت أن تؤثر على نتائج الكروماتوغرافي 2، 3. عمود الآلي الكشفية هو نهج فعال لاختيار وسيلة التحالف الدولي للموئل لتعظيم الاستفادة اللاحقة وتنقية البروتينات 4. ويمكن للطريقة عمود الآلي الكشفية قدمت تكييفه بسهولة لمختلف استراتيجيات الائتلاف تنقية البروتين. قد تغييرات في تركيز الملح، واختيار من الملح، والانحدار والملح، ودرجة الحموضة زيادة تحسين ظروف تنقية، وجرى آثار متفاوتة هذه المعايير الأساسية التي سبق استعراضها 13،14. التحالف الدولي للموئل شطافة تحتوي على هدف المتواجد النقي جزئياويمكن في تنقية أخرى باستخدام تقنية الكروماتوغرافي التكميلية، مثل التبادل الأيوني اللوني (يتم خصم المبلغ المخصص) أو هلام الترشيح / حجم الإقصاء اللوني 9،10.
بسبب الامتصاصية في ضوء فريد من نوعه وخصائص الانبعاثات، ويمكن التعرف على الشخصية من شطف GFP تستخدم في خط ونهج آخر المدى. تحقيقا لهذه الغاية، ويمكن زيادة هذا البروتوكول يمكن تكييفها لتنقية البروتينات GFP-الانصهار المؤتلف، الذي يتم فيه "الموسومة" وهو بروتين الهدف لا علاقة لها مع GFP. ويمكن الكشف عن البروتينات الهدف GFP-المفتاحية للأشعة فوق البنفسجية 11 و تنقيته باستخدام نهج الكروماتوغرافي المختلفة، بما في ذلك استراتيجية تنقية HIC المذكورة أعلاه. لقد أصبح GFP تنقية أيضا عنصرا أساسيا في مختبرات الكيمياء الحيوية التربوية لتدريس التقنيات الحديثة في علم بروتين 12.
في حين يمكن أن تتم تنقية البروتين الأساسي الائتلاف باستخدام أقل قوة بكثير اللوني SYالجذعية، والأجهزة المعروضة هنا لديها عدد من مزايا واضحة للمساعدة في الحصول على نتائج ايجابية. وتشمل الفوائد تحسين ملحوظ في الاستفادة من وجود نظام تشغيل الآلي للغاية للتشغيل حالة التكاثر، والوقت وفورات، وتناقص فرص الهواء لإدخالها في نظام 10. نظام يسيطر مزج العازلة، التي يسرتها الاقصى نظام، ويسمح لزيادة الاتساق في إعداد العازلة واستنساخ التجارب. رسم كاف تحميل عينة في حلقة عينة الحيوية للجميع الكشفية يدير مزيد من يضمن التوحيد من العينة التي تضاف إلى كل عمود، ويسمح للأشواط متتالية دون انقطاع أو إعادة دليل. تسيطر حقن عينة من حلقة عينة على العمود يقلل التقلبات التي قد تحدث مع تحميل عينة دليل. زوج من الصمامات اختيار العمود السماح لتشغيل عينة على التوالي، باستخدام كل عمود مختلف التحالف الدولي للموئل، دون الحاجة إلى replumb النظام. أداء مول TI-الطول الموجي تحليل مفيد على نحو خاص عندما يعاير بروتين مع التشكيل الجانبي للطيفية فريدة من نوعها. بالإضافة إلى GFP، قد السيتوكرومات، flavoproteins، وغيرها من البروتينات الهيم المحتوية على الاستفادة من هذه التقنية. أجهزة رصد الموصلية، ودرجة الحموضة تسمح للتحقق من الوقت الحقيقي والظروف التجريبية. جمع الانقسام شطافة جزء يسمح للتعامل مع جزء محسنة ويمكن نقلها بسهولة عن طرق تحليل ما بعد المدى والتي تتطلب الحد الأدنى من حجم العينة (على سبيل المثال ELISA، SDS PAGE، طخة غربية، وExperion الكهربائي ميكروفلويديك). في حين تعمل على جمع جزء 2 حاليا يتطلب التزامن اليدوي، فإنه يسمح لأقصى قدر من المرونة في اختيار جامع الكسر. عيوب أهم لاستخدام هذا النظام اللوني قوية لعمود الائتلاف الكشفية وتنقية البروتين وتشمل للمرة الأولى والنفقات في الميزانية المرتبطة حيازة الصك وتدريب المشغلين.
تي "> بروتوكول المعروضة هنا يستخدم لبيو راد النظام اللوني DuoFlow، ومع ذلك، قد تستخدم أيضا أدوات قوية على قدم المساواة من الشركات المصنعة الأخرى، مثل أفانت AKTA من GE للرعاية الصحية، تكون وتكون قادرة على تحقيق نتائج تعادل النظام اللوني للمقارنة حتى لها خصائص فريدة من نوعها (على سبيل المثال أسلوب البرمجة، تسمية عنصر، وتفضيل المشغل، وقابلية القيود) التي ينبغي النظر فيها قبل الشروع في إجراء تنقية أو حيازة الصك.Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM086822 ومؤسسة العلوم الوطنية الكبرى منحة بحثية الأجهزة DBI-0960313. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. جون مياكي ودونا هاردي (بيو راد) وجنيفر Loertscher (جامعة سياتل) لخبرتهم التقنية. حدد الكواشف اللوني، وقدمت بسخاء من قبل الأجهزة التكميلية بيو راد.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | High-pressure valve, 9-port, 8-position, 3,500 psi (233 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system |
| Diverter valve SV3T-2 | Bio-Rad | 7600410 | Solenoid valve, 3-port, 2-position, 30 psi (2 bar) limit, for use with BioLogic DuoFlow system |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | ||
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | Sliding-piston sample loop kit, includes 25 ml DynaLoop sliding piston loop, DynaLoop parts kit (#750-0450) |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 7410088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | gradient pump for low-pressure protein purification, includes tubing and fittings kit |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
Riferimenti
- Cummins, P. M., O’Connor, B. F. Hydrophobic interaction chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for “method scouting” protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, . L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E. Fully automated protein purification. Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
