Summary

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Published: December 05, 2011
doi:

Summary

Diese Methode zur Isolierung von funktionellen Immunzellen aus dem Herzen stellt eine Alternative zu den herkömmlichen Methoden der Kollagenaseverdau, die unerwünschten Immun-Zell-Aktivierung verursacht, was zu einer verminderten Reaktionsfähigkeit dieser Zellen. Unsere Methode der Isolierung ergibt funktionelle Herz-Immunzellen durch die Vermeidung von Problemen mit enzymatische Verdauung.

Abstract

Cardiac Immunzellen gewinnen Interesse für die Rollen, die sie spielen in den pathologischen Umbau in vielen Herzerkrankungen 1-5 Diese Immunzellen, die Mastzellen, T-Zellen und Makrophagen gehören,. Speicherung und Freisetzung einer Vielzahl von biologisch aktiven Mediatoren einschließlich Zytokine und Proteasen wie Tryptase. 6-8 Diese Mediatoren haben gezeigt, dass wichtige Akteure in der extrazellulären Matrix Stoffwechsel werden durch die Aktivierung Matrixmetalloproteinasen oder was Kollagenakkumulation durch Modulation der kardialen Fibroblasten-Funktion. 9-11 Allerdings haben verfügbaren Techniken zur Isolierung von Herz-Immunzellen problematisch, weil sie bakterieller Kollagenase, um das Herzmuskelgewebe verdauen verwenden. Diese Technik bewirkt eine Aktivierung der Immunzellen und somit zu einem Verlust der Funktion. Zum Beispiel, kardiale Mastzellen deutlich weniger auf Verbindungen, die Degranulation führen werden. 12 Darum entwickelten wir eine Technik, die für t erlaubtEr Isolation von funktionellen Herz-Immunzellen, die zu einem besseren Verständnis der Rolle dieser Zellen bei Herzerkrankungen führen würde. 13, 14

Diese Methode erfordert eine gewisse Vertrautheit mit der anatomischen Lage der Ratte Xiphoidbasis, Achselhöhle und Lig. falciforme und Perikard des Herzens. Diese Landmarken sind wichtig für den Erfolg des Verfahrens zu erhöhen und eine höhere Ausbeute an Herz-Immunzellen zu gewährleisten. Diese isolierten kardialen Immunzellen können dann für die Charakterisierung der Funktionalität, Erscheinungsbild, Reife und Co-Kultur-Experimente mit anderen Herzzellen zu einem besseren Verständnis ihrer Wechselwirkungen zu gewinnen verwendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung Hanks 'Balance Salt Solution (HBSS) Autoclave 1 L Becherglas, absolvierte 1000 ml Zylinder und Rührstab. Bereiten Sie die HBSS Pulver Lösung im Autoklaven 1 L Becherglas auf die 900 mL Marke mit doppelt destilliertem Wasser. Mix HBSS-Lösung mit 3,4 g Hepes Na + Salz-und pH-Wert auf einen Wert zwischen 7,35-7,41 entweder mit konzentrierter HCL oder NaOH. Sobald der gewünschte pH erreicht ist und bleibt stabil, 5 g Rinderserumalbumin, um die Lösung bei Raum…

Discussion

Dieses Verfahren zur Isolierung von Herz-Immunzellen ermöglicht die Analyse ihrer Funktion, Phänotyp und Reife, ohne die ungewollte Aktivierung, die typischerweise während einer traditionellen enzymatische Verdauung Isolation Technik. Die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen mit dieser Technik erhält man rund 400.000 pro Ratte Herz und Differential-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse dieser Zellen zeigt gemischte Population von T-Lymphozyten (~ 70%), Makrophagen (~ 12%) und Mastzellen mit die Verwendung die…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch ein UNCF-Merck Graduate Science Research Dissertation Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute gewährt RO1-HL-62228 (JSJ) und RO1-HL-073990 (JSJ) unterstützt.

Materials

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
Hanks’ Balanced Salt Sigma H4891 One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt
Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt
Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic Gibco 15240-062  
HEPES Sigma H3784  
Bovine Serum Albumin Sigma A3912  
250 mL Nalogene Filter Bottle Thermoscientific 157-0020  
12 N HCL Fisher Scientific CAS 7647-01-0 For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH Fisher Scientific SC267 For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water      

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
3-O Suture Silk Braided Ethicon Products SA64H  
Small Animal Ventilator CWE Incorporated SAR-830 Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle BD Biosciences 305199 Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter Baxter 2N111 Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe Fisher Scientific 14-823-16B  
15 mL Falcon Tubes BD Biosciences 352097  
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge Fisher Scientific 75-004-377 Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone Thermoscientific S300030.02  
Hemocytometer Hausser Scientific HS-LB-1483  

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
McLarty, J. L., Meléndez, G. C., Spencer, W. J., Levick, S. P., Brower, G. L., Janicki, J. S. Isolation of Functional Cardiac Immune Cells. J. Vis. Exp. (58), e3020, doi:10.3791/3020 (2011).

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