一种高通量自动化的平台，制造蛋白质治疗的细胞系发展

1。主机细胞转染种子2 × 10 6 CHO – DXB11细胞在T75康宁的细胞培养瓶15毫升生长培养基（MEMA核苷酸和核苷（GIBCO，目录编号为12571），辅以10％的γ-辐照特点胎牛血清（cFBS）（Hyclone公司，目录编号SH30071.03）和10毫升/大号45％葡萄糖溶液（Sigma公司，目录号G8769））转染前一天。 在转染时，准备转染复合物如下： 在800μL培养液稀释，在无菌的离心管血清8微克的DNA。轻轻混匀。 无血清中的聚苯乙烯管，800μL培养液稀释40μL脂质体™（Invitrogen公司18324012）。 将稀释后的DNA稀释的脂质体™。轻轻混匀，30分钟，在室温下孵育。 删除从细胞的培养基中，在T75和无血清6.4毫升培养液取代。加入转染复合物1.6毫升的容量瓶中。摇板，轻轻混匀。 6个小时，在CO 2培养箱孵育的细胞在37 ° C。 加入8毫升培养液的烧瓶中，在37 °的CO 2培养箱中过夜彗星。 取出吸液并添加新鲜生长培养基的烧瓶中。的CO 2培养箱中过夜培养的细胞在37 ° C。 选择培养基更换生长培养基（MEMA介质无核苷酸或核苷（GIBCO，目录编号为12561），辅以10％（DFB）的γ辐照透析胎牛血清（Hyclone公司，产品目录号SH30079.03）和10 mL / L的45 ％葡萄糖溶液（Sigma公司，目录号G8769））。 在37 ° C的细胞中的CO 2培养箱培养2-3周。 2。流式细胞仪检测激活细胞分选的克隆撞出5分钟从烧瓶中，在800转的离心机细胞在4 ° C。 辅以2％牛血清白蛋白，荧光标记的抗人IgG抗体在1:20稀释的选择培养基重悬细胞。 孵育冰浴15-30分钟，然后用冷PBS洗两次。在1X PBS重悬在聚丙烯管细胞。 准备在BD FACSAria™无菌排序。准备96孔细胞培养板，包含在每孔200μL选择培养基。 无菌负载管与细胞和BD FACSAria™分析，记录的结果，分别染色和未染色细胞。 设置的大门，设置分类到96孔板（S）的单细胞所需的荧光染色轮廓。 转染细胞中首先分析了基于前向散射对侧向散射。一个活细胞的大门，是基于前向散射，测量细胞的大小，侧向散射，是衡量一个细胞的复杂性或粒度。 属于这扇大门内的细胞，然后用于PE染色检查。 PE负栅极设置为不染转染的细胞或染的宿主细胞。 “高PE”门染色流式细胞仪检测转染细胞，然后划定包括所有用于PE染色阳性的细胞，前5％。 两个星期，在37 °彗星孵化器孵育的板块。 3。集落形成的文件CloneSelect™成像仪 0天，第3天，7天，排序后流式细胞仪第13天CloneSelect成像™96孔板的文件集落形成。图像文件将确保，从一个单细胞产生的克隆选择。在本文档中的一个关键的步骤是让焦平面正确调整为0天测量，因为在这一点上只有一个细胞在每口井。这是非常重要的，这些单个细胞的图像的重点和试图调整对他们的重点，充其量可能会产生误导。焦平面可以显著不同板块之间的品牌，甚至可能从很多很多同一品牌。因此需要使用预先确定的焦平面。这可以通过重点测试微珠或存入板所使用的同一地段的高密度细胞。另外，同一地段，完全成长板可用于这一目的。流式细胞仪进行排序后，它也是重要的是让细胞成像前至少2小时定居，让他们将被“固定”在上板的位置。 4。高生产力的克隆筛选和选择在接收的96孔检测板的文件样本的位置。 20μL上清（如果有必要稀释）到96孔检测板TECAN自由EVO ®液体处理系统的传输等份。这种灵活的和有能力的机器人IC设计平台已经适应和其他自动细胞培养工作。特别节目的书面最好地利用和增强细胞系开发的机器人功能的Freedom EVO。这样的一个例子是设置TECAN公司解释CloneSelect™热像仪的数据采样与单菌落井。其他节目都必须执行额外的细胞，如文化的任务，使所采取的样品适当稀释，解释，目录和手动标记的样品板，如果需要，扩大规模生产克隆高，等这些方案中有许多可以很容易地适用于384孔板以及原来的96孔格式。 分析样品中的抗体生产三明治人类检测IgG抗体酶联免疫吸附（皮尔斯，罗克福德，IL）TECAN自由EVO ®液体处理系统。 样品和标准（人类IgG1的多发性骨髓瘤，KAPPA）（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州）预涂层的生物涂层的抗人IgG含量的板（BD公司，加利福尼亚州圣何塞，）加载。 室温孵育两个小时，三个PBS洗涤板。 ImmunoPure山羊抗人IgG（FC -γ）- HRP（皮尔斯，罗克福德，IL）被添加到该板块在1:2000稀释，并在室温下1小时孵育。 板，用PBS洗三次之前加入ABTS底物（皮尔斯，罗克福德，IL），在盘子上使用的检测在405 nm处的吸光度读者读。 选择高生产力的克隆和评估中的悬浮培养的生产力。补料分批培养，细胞接种0.3X106细胞/ mL蛋白的培养基JRH直接的好处中，65578（SAFC Biosciences公司，列涅萨，KS）与5 g / L的大豆蛋白水解物（DMV国际，目录号SE50MAF – UF，很多补充7.5％的CO 2号）和孵育在37 ° C。文化的继续和补充为2 g / L葡萄糖（Sigma公司，目录编号为G8769，批号098K2329）当葡萄糖加文化中的乳酸浓度低于2 g / L的达成，以及美联储2毫米谷氨酰胺​​（Gibco公司，目录编号25030，批号568177），谷氨酰胺水平时达到低于200毫克/升（YSI生物分析仪测得的代谢产物）。补料分批培养第14天终止和抗体的产生反相高效液相色谱法测定。 荧光原位杂交（FISH）5候选克隆的遗传特性。 5。代表性的成果： 例如开发抗体生产克隆与高通量方法是在图1和图2所示。转染细胞池染色与荧光标记的抗人IgG抗体（图1A），分析和BD FACSAria™（图1B）排序。菌落形成在96孔板上成像CloneSelect成像™（图1C）。细胞培养上清中包含单个菌落从井采样，并用ELISA法测定TECAN自由EVO ®液体处理系统（图1D）。高生产率的克隆细胞表现出较高的表面抗体水平与荧光标记的抗人IgG抗体染色反映。当比较两个种群的初始转染细胞池，在生产力的巨大差异在补料分批，文化观察（图2）产生的克隆。从表面抗体高表达的细胞（PE高）人口产生的前两名克隆，具体生产力介于50-70皮克/细胞/天。而抗体生产力〜20皮克/细胞/天的前两名从低表面抗体的表达（PE低）的细胞群产生的克隆。此外，通过流式细胞仪排序的细胞株更稳定，比那些通过人工黎明稀释（图3A）克隆抗体生产。顶级克隆特定的生产力，“克隆”，由手动黎明稀释生成的下降〜30〜10培养80细胞倍增后PCD PCD。另一方面，顶部的亚克隆进行排序，“克隆2”流式细胞仪产生的，是能够保持至少100个细胞倍增约20 PCD的具体生产力。荧光原位杂交（FISH），我们证明克隆1的表型的混合人口显示一个（85％）和表型B（15％）。相比之下，流式细胞仪排序克隆（克隆2）显示，99.5％的细胞要更均匀的人口，被证明是表型（图3B）。 图1。CHO细胞生产单克隆抗体制造细胞系的发展。一）初始转染细胞池的表面染色，用荧光标记的抗人IgG抗体。二）到96孔板细胞具有较高的荧光强度（PE高）和荧光强度低（低PE）的人口排序。三）记录殖民地从第一天开始形成0至13天CloneSelect成像™后播种。四）通过ELISA筛选克隆。 图2表面抗体水平相关抗体细胞的生产力。高和低的荧光染色的克隆均发展成细胞株和补料分批培养进行评估。体积滴度和前2每个种群的克隆之间进行了比较具体的生产力。 图3。流式细胞仪排序表现出较高的遗传的同质性和克隆稳定性产生的克隆。一）抗体在分批培养生产的稳定〜80文化经过时间的细胞倍增。 Δ，克隆通过有限稀释，细胞接种在2000细胞/孔，1000个细胞/孔和500个细胞/孔产生。 ，克隆是通过1 /细胞流式细胞仪生成。二）转基因整合位点在CHO细胞染色体荧光原位杂交鉴定。