Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

1. Assemblée Bloc de montage Le bloc de plexiglas de montage (figure 1A) doit être faite selon les spécifications exactes indiquées dans le plan (disponible auprès de http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) Pour permettre un montage facile et une dissection de la mouche. Le fil à travers les vis de l'arrière, mais ne les s'étendent au-delà de la face du bloc; leur position est réglé pendant la préparation de l'animal (voir 2,7). L'utilisation d'un semoir de précision, faire une brèche dans la frontière supérieure de la chambre circulaire de la mouche, à creuser sous la surface pour faire place à corps de la mouche, la réduction de l'épaisseur du bloc à ce point. Couper une grille de cuivre avec une perpendiculaire scalpel et à proximité du fond de la fente afin de créer un «collier». Assurez-vous que les deux volets qui en résultent sont au même niveau, car cela aidera l'insertion de la mouche. Avec un cure-dent, placez une petite goutte de superglue sur le bloc de montage ci-dessus de la chambre circulaire de la mouche. Placer la grille de cuivre sur la colle et la position de sorte que la fente est centrée sur le bloc (figure 1A). Appuyez doucement et retirer tout excès de colle. Avec une paire de pinces à épiler, ajouter quelques gouttes minuscules de colle sous les rabats de chaque côté et plier la grille sur la face avant du bloc de telle sorte que la fente est orientée vers le bas droite. Assurez-vous que le haut de la grille est de niveau avec le bloc. Laisser sécher complètement. Assembler un support de fil: couper une lamelle en plastique en deux et enlever une pièce centrale de faire un "U". Utilisez la cire d'abeille à coller un morceau de fil dans la partie supérieure du "U"; ne font pas le fil trop tendu. Construire le bouclier antennaire: faire un trou dans une lamelle en plastique avec un papier de perforation. Couper les bords de la lamelle à 0,5 x 0,7 cm. Collez la lamelle percée en plastique pour ruban adhésif, puis déposer une goutte d'éthanol sur la bande exposée à travers le trou deenlever l'adhésif. 2. Préparation des animaux Les mouches du génotype appropriée – c.-à-porter la combinaison souhaitée de "pilote" et l'activité-journaliste transgènes – devrait être de 1-3 semaines ancienne; la cuticule des mouches plus jeunes est trop mou et difficile à couper. Lorsque les expériences exigent une comparaison directe de différents génotypes, et afin de correspondre à l'expression du transgène niveaux, les mouches doivent être appariés pour l'âge afin d'éviter liées à l'âge des différences physiologiques. Si le genre n'est pas important, nous préférons utiliser des mouches femelles car ils ont une tête plus grosse et plus faciles à manipuler. Anesthésier mouches par refroidissement sur de la glace. Introduire une mouche dans le bloc de montage. Maintenir la volée par l'articulation de l'aile et le faire glisser, dorsale-première surface, le long de la fente de la grille de cuivre de manière à être suspendue par son col (figure 1B-C). Si nécessaire, le faire pivoter jusqu'à ce qu'il regarde vers le bas. Placez une épine de cactus bien en face de la fment la tête pour l'empêcher de s'échapper (Figure 1B-C). Placez le épine de cactus en face de la trompe pour l'empêcher de bouger. Fixer le épine de cactus pour le bloc en utilisant la cire d'abeille. Assurez-vous que le haut de la tête est au niveau du haut du bloc. Fixer la tête de la mouche sur le bloc avec une petite goutte de colophane (dissous dans de l'éthanol). Placer le bloc dans une zone de humidifié et permettre à la colophane durcir pendant environ une heure. En utilisant des pinces, tirez sur la plaque antennaire déposer et le fil sur le support (cire-latérale; voir 1.5) dans le pli cuticulaire entre l'antenne et la tête. Fixez le support à l'avant du bloc de cire d'abeille. En utilisant les vis construits dans le bloc, poussez doucement le support de fil avant pour créer un espace entre la plaque antennaire et la tête. Placer le bouclier antennaire (voir 1.6) au-dessus de la tête de la mouche avec le trou placé au centre. Fixer avec la cire d'abeille à la partie supérieure du bloc de montage. Utilisation d'une lame-séparateur, cuta petit trou dans la bande sur le bouclier d'exposer la cuticule de la tête de la mouche derrière l'antenne. Le trou ne doit pas s'étendre au-delà des yeux pour éviter la préparation de la fuite. Sceller le trou entre le ruban et la cuticule avec deux composants en silicium. Retirez tout excès de silicium à partir du dessus de la tête de la mouche. Déposer une goutte de solution saline de Ringer drosophile (130 mM NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 36 mM de saccharose, 5 mM d'HEPES, pH 7,3) sur la tête. Assurez-vous qu'il n'y a pas de fuites: les antennes doivent rester complètement sec. En utilisant une lame de saphir, découpez un trou dans la cuticule. Tout d'abord, la légère note le long du pli cuticulaire directement derrière l'antenne, puis couper le long des yeux et à travers les ocelles sur le dos. Enfin, plier la pièce de la cuticule sur le bord marqué et coupé de la partie inférieure pour éviter la rupture des nerfs antennaires. Retirez délicatement les glandes et de la trachée avec des pincettes fines. Rincez à plusieurs reprises avec la drosophile </em> de Ringer, en laissant une grosse goutte sur la tête. 3. Livraison de stimulation de l'odeur Odeur: seringues insérer un tampon de cellulose dans une seringue de 2 ml en plastique avec des pinces propres et pipette sur celui-ci (à l'aide des conseils de filtre) 20 pl de l'odeur, dilués comme vous le souhaitez dans un solvant approprié, en utilisant la pointe de la pipette à pousser la plaquette en profondeur dans le canon . Plug-and-bouchon de la seringue jusqu'à ce que nécessaire. Dilutions des odeurs fraîches doivent être préparées au moins tous les 3 mois (ou plus fréquemment des odeurs très volatiles et / ou souvent utilisé), et de nouvelles plaquettes doivent être préparés pour les seringues odeur juste avant chaque session d'enregistrement. Ne pas utiliser de tampons d'odeur pendant plus de trois stimulations, puisque la concentration d'odeur pourrait se désintégrer. Sur mesure olfactomètre (Figure 2): un courant d'air primaire (1 l / min) est dirigée à travers un tube en Téflon (0,4 mm de diamètre interne); 27 cm en amont de la sortie de ce tube, un courant d'air secondaire (1 l / min ) est ajouté. Les deux courants d'air sont générés par les pompes à membrane, etle débit est régulé par deux débitmètres indépendants. Les courants d'air peut être humidifié en passant par l'eau dans des bouteilles de gaz de lavage, même si les soins doivent être prises pour éviter la sur-humidification (soit plus de ~ 60%). Le courant d'air secondaire est dirigé soit par une seringue ou d'odeur une seringue vide: seringues sont reliés à l'écoulement d'air à travers une aiguille de seringue (1,2 mm de diamètre extérieur) perçant le piston. Une vanne à trois voies magnétique contrôlé par une unité de commande de soupape (VC6 par exemple Harvard Apparatus) est utilisé pour basculer entre l'air pur et le stimulus odeur. 4. L'imagerie in vivo Nous décrivons ici l'imagerie à l'aide d'un microscope fluorescent verticale (par exemple en position verticale fixe scène Zeiss Axio examinateur D1) équipé d'un objectif 20x de l'eau (p. ex Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (Figure 2). Pour l'imagerie avec le G-CAMP (excitation / émission: 488/509 nm), utilisez un bloc filtre avec les propriétés suivantes: 450-490 nm filtre d'excitation, Miroir dichroïque (T495LP) et 500-550 nm filtre d'émission (Chroma HE). Placez le bloc de montage contenant la volée sous le microscope. Positionner la sortie des environ 0,5 cm à l'avant olfactomètre d'antennes de la mouche. Abaisser l'objectif jusqu'à ce qu'il touche la solution de Ringer sur la tête de la mouche. En regardant à travers le spectateur sous éclairage sur fond clair, la position de la préparation afin que le trou dans la capsule de la tête est centrée et ses frontières sont au point. Mettre à la lumière fluorescente et d'ajuster la mise au point jusqu'à ce que vous pouvez voir les neurones marqués (ressort de fluorescence verte basale de G-CAMP). Mise au point fine sur les glomérules d'intérêt par l'acquisition des images avec un dispositif à couplage de charge (CCD) (par exemple Coolsnap-HQ2 système de caméra numérique) monté sur le microscope en utilisant un logiciel d'acquisition approprié (par exemple Metafluor) (figure 3A). Fermer le diaphragme dans le trajet de lumière d'illumination pour limiter la lumière d'excitation à la zone imagée. Pour enregistrer odeur évoquéel'activité, définir la cadence d'acquisition à 4 Hz et ajuster le temps d'exposition pour obtenir des valeurs de fluorescence dans la plage dynamique de votre caméra CCD, mais pas inférieure à 1000 (unités arbitraires), avec au moins 12 bits de résolution dynamique. Le temps d'exposition ne doit pas dépasser 100 ms, si possible, pour réduire les G-CAMP photoblanchiment. Si la résolution spatiale de votre appareil photo le permet, vous pouvez augmenter le binning (nombre de puits sur la puce qui sera mis en cellule dans un pixel numérique) afin de réduire le temps d'exposition. On obtient des images des pixels (350×225 avec un binning de 2×2), correspondant à 210×135 um à la préparation. Ces paramètres sont optimales pour capturer l'odeur glomérulaires réponses induites par des G-Camp avec une résolution spatiale et temporelle tout en limitant bonne journaliste de blanchiment. Définissez les paramètres de mesure. En général, nous enregistrer pendant 10 secondes (soit 40 cadres), avec une stimulation odeur typique de départ de 4 secondes après le début de la période d'acquisition (cadre 15) et une durée d'une seconde (uusqu'à cadre 19). Une préparation à la mouche peut normalement être testés avec jusqu'à 25-30 stimuli odeurs différentes, souvent limitées par un déclin irréversible du signal fluorescent du reporter en raison de photoblanchiment. L'intervalle inter-stimulus dépendra de la force de la réponse observée et le taux de photoblanchiment. La longueur appropriée de l'intervalle inter-stimulus pour éviter l'adaptation sensorielle peut être déterminé de façon approximative par la présentation répétée d'une odeur de contrôle positif (s'il est connu) dans des expériences de première instance. L'inclusion de cette odeur toutes les ~ 10 stimuli dans une série donnée peut permettre la vérification de la viabilité et la réactivité constante de la préparation. 5. Traitement et analyse des données Les données sont traitées à l'aide ImageJ (avec Mac biophotonique plug-in, www.macbiophotonics.ca ) et des programmes personnalisés écrits en Matlab et R comme suit: Corriger les artefacts de mouvement de l'échantillon:aligner toutes les images correspondant à une préparation des animaux (par exemple 30 mesures de 40 trames chacune) en utilisant le "corps rigide" mode de StackReg / TurboReg ( bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg ) dans ImageJ. Cette étape est nécessaire pour éliminer des changements dans la position des neurones marqués par rapport à la trame d'acquisition à l'intérieur et entre les mesures. Cependant, il est seulement possible de supprimer des changements dans le plan xy. Les données doivent être jetés s'ils ont de forts changements en bref se produire. Segment de la pile dans individuels mesures de 10 secondes (40-cadre). Corriger pour le blanchiment des artefacts: l'exposition à la lumière fluorescente provoquer la fluorescence à la pourriture lors d'une mesure unique de 10. Dans certains cas, il est important de corriger cette décadence avant d'analyser les données. Pour chaque mesure de calculer une trame de fond. Cela devrait être la moyenne de plusieurs trames avant le début du stimulus (p.ex. armatures 6-14). Divisez chaque trame par cette backgautour trame afin d'obtenir les changements relatifs de fluorescence. Calculer la valeur moyenne relative de fluorescence pour chaque trame en faisant la moyenne de tous les pixels dans la zone marquée par le G-CAMP. Monter une exponentielle double la courbe moyenne de fluorescence, donnant davantage de poids aux images avant le stimulus et un poids nul à l'époque de la réponse des odeurs (20 images après le début du stimulus dans notre cas). Soustraire la courbe ajustée de la courbe de rapport de fluorescence de chaque pixel. Multiplier les cadres corrigées par la trame de fond de ré-obtenir des données brutes. Ce type de correction peut conduire à une modification de la dynamique de réponse si le signal ne retourne pas à la ligne de base d'ici la fin de la mesure (par exemple, si inhibitrices ou très fort réponses excitatrices sont évoqués) (figure 4). Bien que la correction des artefacts de blanchiment est utile dans de nombreux cas, l'interprétation des paramètres temporels devraient être faites avec prudence, si une correction est appliquée l'eau de Javel. Calculer la variation relative de la fluorescence (& Delta; F / F) pour chaque trame de chaque mesure que (F i-F 0) / F 0 * 100, où F 0 est la trame de fond (voir 5.3), et F i la valeur de fluorescence pour la trame i-ième la mesure. Calculer la moyenne AF / F au sein d'une région circulaire d'intérêt dans un glomérule (figure 3B) avec un diamètre de 10 pixels pour obtenir des traces d'activité (figure 5A). Si vous le souhaitez, de transformer ces traces en utilisant heatmaps ImageJ (figure 5A). Calculer l'amplitude du pic de la réponse en soustrayant la moyenne AF / F de quatre cadres avant la stimulation de la moyenne AF / F de quatre cadres pendant le pic de la réponse. La même procédure est utilisée à la fois pour illustrer les schémas de réponse spatiale (voir figure 3B) et de quantifier l'amplitude de la réponse dans des régions spécifiques d'intérêt à travers les mouches (voir la figure 5B). La réponse de crête peut également être quantifié par l'intégration de la zone en dessous de la courbe du temps de l'impulsion, ou averaging les cadres autour du maximum de la réponse. 6. Les résultats représentatifs Nous avons utilisé les protocoles ci-dessus pour enregistrer et analyser les réponses propionique acide évoqués de mouches exprimant G-28 CaMP1.6 sous le contrôle du promoteur pour le co-récepteur olfactif IR8a, qui est active dans plusieurs populations différentes de 29,30 ARS ( Figures 3-5). La stimulation par l'acide propionique à 1% provoque une augmentation du G-CAMP fluorescence – indiquant une augmentation du calcium intracellulaire – en ARS innervant deux glomérules, DC4 et DP1l (figure 3B). Nous illustrons différentes façons de représenter les données de mouches multiples de la figure 5: des traces d'activité en ligne, et une intrigue Heatmaps barre des réponses de pointe. Réponses acide propionique-évoqués ont des amplitudes de pointe distinctes et dynamiques temporelles dans DC4 et DP1l. En outre, bien que les réponses sont généralement robustes, la variabilité entre les animaux individuels peuvent également être observées à la fois dans les glomérules (il voiratmaps dans la figure 5A). Quantification des réponses de pointe (figure 5B) permet une comparaison statistique simple entre différents glomérules et odorants différents à travers les animaux. Cependant, les odeurs évoquées les réponses de calcium peut avoir non-uniformes dynamique temporelle, et de quantifier leur ampleur avec une seule valeur ne tient pas compte de cette complexité. Figure 1. Schéma du bloc de montage (A) avant et (B) après l'introduction de la mouche, et (C) une vue de dessus en close-up (adapté à partir du 31). Figure 2. Schéma du dispositif expérimental mis en place. Figure 3. (A) Vue d'en haut de la préparation à la mouche après l'étape 2.8 (panneau de gauche) et des matières premières image de fluorescence de l'antelobes NNAL étiquetés avec le G-CaMP1.6 (génotype: promoteur IR8a: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 et DP1l glomérules peuvent être distingués par leur morphologie, la taille et la position et sont marqués en rouge et bleu, respectivement. (B) de couleur sur l'image codée en réponse à de l'acide propionique (1% v / v). L'image correspond à la AF / F du pic de la réponse calculée comme il est expliqué à l'étape 5.6 (voir aussi la figure 5A). Le ColorScale sur la gauche indique le% AF / F valeur. Les cercles noirs indiquent la position et la taille de la région d'intérêt utilisé pour quantifier les réponses (voir figure 5). Figure 4. Correction de blanchiment du signal rapporteur fluorescent. Des exemples de l'effet de la correction de blanchiment tel que décrit à l'étape 5.3. Les données d'échantillon sur le panneau de gauche peuvent être corrigés sans changements majeurs dans la forme de la réponse. Les données d'échantillon sur le panneau de droite est sévèrement affectered par la correction eau de Javel, probablement parce que la chute du signal et est maintenue en dessous de référence après la fin de relance odeur. Figure 5 (A) Haut:. Dynamique temporelle de réponses calciques de glomérules DC4 (à gauche) et DP1l (à droite) à l'acide propionique (1% v / v). Les traces noires montrent la médiane de l'AF moyenne / F au sein de la région d'intérêt (voir figure 3B) à travers huit animaux. La surface grise indique l'écart entre les premier et troisième quartiles de la distribution. Présentation des valeurs médianes et quartile fournit plus d'informations sur la variabilité et la distribution des réponses observées que l'erreur moyenne et standard. Les cases vertes et magenta indiquent les cadres en moyenne pour calculer les réponses maximales indiquées sur la figure 3B, et quantifiés dans la figure 5B. En bas: les cartes thermiques montrent les données de réponse pour tous les animaux individuels dans des rangées séparées, avec AF / F des valeurs represented par le ColorScale (extrême droite). Les barres horizontales noires indiquent l'heure et la durée du stimulus. (B) médians des réponses maximales à l'acide propionique dans huit animaux pour DC4 et DP1l glomérules. Les barres d'erreur indiquent l'écart entre premier et troisième quartiles de la distribution.