Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici
Summary
Quantificare i livelli di HIV-1 RNA nel plasma e sequenziamento singolo HIV-1 genomi di individui con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità (50-75 copie / ml) è difficile. Qui si descrive come estrarre e quantificare l'RNA virale plasmatico usando un test PCR in tempo reale che misura affidabile HIV-1 RNA fino a 0,3 copie / ml e come amplificare genomi virali mediante sequenziamento del genoma unico, da campioni con una carica virale molto bassa.
Abstract
Amplificando i geni virali e la quantificazione di HIV-1 RNA di HIV-1 individui infetti con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità da test standard (sotto 50-75 copie / ml) è necessario per ottenere informazioni alla dinamica virale e le interazioni ospite del virus in pazienti che naturalmente controllare l'infezione e coloro che sono in terapia antiretrovirale combinata (CART).
Qui si descrivono come amplificare genomi virali da sequenziamento del genoma singolo (il protocollo SGS) 13, 19 e come quantificare con precisione HIV-1 RNA nei pazienti con bassa carica virale (la singola copia saggio (SCA) protocollo) 12, 20.
Il singolo-copia saggio è un real-time PCR con sensibilità a seconda del volume di plasma essere analizzati. Se un singolo genoma del virus viene rilevato in 7 ml di plasma, quindi il numero di copie di RNA è segnalato per essere 0,3 copie / ml. Il test è un test di controllo interno per l'efficienza di estrazione di RNA, e controlli per l'amplificazione del DNA o da possibili contaminazioni. I campioni dei pazienti sono misurati in triplice copia.
Il singolo test di sequenziamento del genoma (SGS), oggi largamente utilizzati e considerati non-lavoro intensivo 3, 7, 12, 14, 15, è un test di diluizione limite, in cui endpoint diluito prodotto cDNA si estende su una da 96 pozzetti piatto. Secondo una distribuzione di Poisson, quando meno di 1 / 3 dei pozzi danno prodotto, c'è una probabilità 80% della risultante prodotto di PCR è di amplificazione da una singola molecola di cDNA. SGS ha il vantaggio sulla clonazione di non essere sottoposto a ricampionamento e di non essere prevenuto mediante PCR-introdotto ricombinazione 19. Tuttavia, il successo di amplificazione di SCA e SGS dipendono dal disegno primer. Entrambi i saggi sono stati sviluppati per l'Hiv-1 sottotipo B, ma può essere adattato per altri sottotipi e in altre regioni del genoma di primer cambiando, sonde, e standard.
Protocol
Discussion
HIV-1 individui infetti in trattamento antiretrovirale combinata (CART) o che naturalmente controllare l'infezione hanno carica virale molto bassa, in genere circa 1 copia per ml di plasma 4, 11, 12, 17, 18. Carica virale nei pazienti con controllo naturale, spesso oscillare intorno ad un singolo set di punto 1, 2, 17. La sensibilità del test è descritto nel presente documento dipende in larga misura il volume di ingresso di plasma. In generale, abbiamo lavorato con 7 ml di plasma, ma i risul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i pazienti che hanno partecipato a numerosi studi di HIV-1.
JMC era un professore di ricerca della American Cancer Society con il sostegno della Fondazione FM Kirby.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Strategene | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | Gibco/Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 |
| Name of Euipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | any | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | ||
| 1 ml centrifuge tubes | any | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorval | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collection tubes any brand
Riferimenti
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