Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays
Summary
Die Quantifizierung der HIV-1 RNA im Plasma und Sequenzierung einzelner HIV-1 Genome von Individuen mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze (50-75 Kopien / ml) ist schwierig. Hier beschreiben wir, wie zu extrahieren und zu quantifizieren, Plasma-Virus-RNA mit Hilfe eines Echtzeit-PCR-Assay, der zuverlässig misst HIV-1 RNA bis zu 0,3 Kopien / ml und wie man virale Genome von einzelnen Genomsequenzierung verstärken, von Proben mit sehr niedrigen Viruslast.
Abstract
Amplifikation viraler Gene und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-1 infizierten Patienten mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von Standard-Tests (unter 50-75 Kopien / ml) ist notwendig, um einen Einblick zu viralen Dynamik und Virus Wirt-Interaktionen zu gewinnen bei Patienten, die natürlich Kontrolle der Infektion und diejenigen, die auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie (cART) sind.
Hier beschreiben wir, wie man virale Genome von einzelnen Genoms (die SGS-Protokoll) 13, 19 und wie genau quantifizieren HIV-1 RNA bei Patienten mit niedrigen Viruslast (die Single-Copy-Test (SCA)-Protokoll) 12, 20 zu verstärken.
Die Single-copy-Assay ist ein real-time PCR-Assay mit Empfindlichkeit in Abhängigkeit vom Volumen des Plasmas untersucht. Wenn ein einzelner Virus-Genom in 7 ml Plasma erkannt wird, dann ist die RNA-Kopienzahl gemeldet zu 0,3 Kopien / ml liegen. Der Test hat ein internes Kontrollsystem Tests für die Effizienz der RNA-Extraktion und Steuerungen für möglich Amplifikation aus DNA oder Verunreinigung. Patientenproben sind in dreifacher Ausfertigung gemessen.
Die Single-Genom-Sequenzierung Assay (SGS), mittlerweile weit verbreitet und als nicht arbeitsintensiv 3, 7, 12, 14, 15, ist ein limitierender Verdünnung Assay, in dem Endpunkt verdünnten cDNA Produkt über einen 96-Loch verteilt Platte. Laut einer Poisson-Verteilung, wenn weniger als 1 / 3 der Brunnen Produkt geben, gibt es eine 80% ige Chance, das PCR-Produkt wird resultierenden Verstärkung von einer einzigen cDNA-Molekül. SGS hat den Vorteil, über das Klonen von nicht zu Resampling unterzogen und nicht durch PCR eingeführt Rekombination 19 vorgespannt. Allerdings hängen die Verstärkung Erfolg von SCA und SGS auf Primer-Design. Beide Tests wurden für HIV-1 Subtyp B entwickelt, kann aber für andere Subtypen und anderen Regionen des Genoms, indem Primer, Sonden und Standards angepasst werden.
Protocol
Discussion
HIV-1 infizierten Personen auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie behandelt (cART) oder die natürlich kontrollieren die Infektion haben eine sehr niedrige Viruslast, typischerweise etwa 1 Exemplar pro ml Plasma 4, 11, 12, 17, 18. Viruslast bei Patienten mit natürlichen Kontrolle, oft um einen individuellen Sollwert 1, 2, 17 schwanken. Die Empfindlichkeit des hier beschriebenen Tests ist stark abhängig von der Eingabe Volumen von Plasma. Generell haben wir mit 7 ml Plasma gearbeitet, abe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Patienten, die in den zahlreichen Studien von HIV-1 beteiligt zu bestätigen.
JMC war ein Research Professor der American Cancer Society mit Unterstützung der FM Kirby Foundation.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Strategene | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | Gibco/Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 |
| Name of Euipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | any | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | ||
| 1 ml centrifuge tubes | any | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorval | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collection tubes any brand
Riferimenti
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