Modeling Neural Immune Signalisierung von episodischen und chronischen Migräne mit Spreading Depression In Vitro</em

Einige Punkte sind hervorzuheben für ein erfolgreiches Studium von Immun-bezogene SD-Signalisierung in Hirnschnitten. Zunächst muss die Einleitung Reize synchron depolarisieren ein ausreichendes Volumen der grauen Substanz des Gehirns zu SD einzuleiten. Dies bedeutet eine Interface-Konfiguration (dh Flüssigkeit Exposition nur unterhalb und Gasaustausch über slice Kultur einfügen) ist erforderlich. 1,2 Zweitens akuten Hirnschnitten aufrecht SD aber Trauma aus ihrer Herstellung sowie die Verwendung von 95%-Sauerstoff belüftet Ringer-Lösung zu generieren pro-entzündlichen Veränderungen und epileptiforme Verhalten bzw. die neuronalen Schaltkreis Funktion und Immunhomöostase ändern. 3 Dritte kann, während Hippocampus Scheibe Kulturen zu überwinden diesen akuten Scheibe Einschränkungen, ist es wichtig zu beachten, dass Slice Kulturen für eine ausreichende Fristen bis gehalten werden verwenden (dh mehr als 10 Tage in vitro), so dass Mikroglia und Astrozyten Ruhestrom geworden. 3-5 Schließlich SD induzierte sollten mit sterilen und aseptischen Techniken. Die Techniken, die unten beschrieben sind entworfen, um dieses Bedürfnis zu erfüllen. 1. Spreading Depression in Scheiben Kulturen Kultur Erstellung und Pflege. Slice-Kulturen hergestellt und in Pferdeserum-basierte Medium oder einem Serum-freien Medium (SFM) 6,7, wie oben beschrieben 8 mit geringen Modifikationen auf das Medium gehalten. Incubation Parameter sind 36 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit-balance Luft. Wir finden, dass Kulturen zu einem SFM kann nach 18 Tagen in vitro eingeschaltet und gewartet werden, bis mindestens 35 Tage in vitro durch die Verwendung unserer zuvor definierten SFM, dass zusätzliche Kalzium und Magnesium enthält. Darüber hinaus Antibiotika und einem Fungizid hinzugefügt werden, um Infektionskrankheiten Kontamination mit mehreren Aufnahmen Episoden assoziiert zu verhindern. Diese langfristige (oder Aufnahme) Medium Formulierung enthält (pro 100 ml): Neurobosal Medium, 97 ml; Gem-21, 2,0 mL; Glutamax (200 mM), 0,5 mL; Gentamycin (10 mg / mL), 10 l; D-Glucose (45%), 680 ul; Ascorbinsäure (0,5 M), 100 ul; Fungizone, (250 mg / mL), 400 ul; NaCl (5,0 M), 820 ul, Mg 2 Cl 2 (1,0 M) , 80 ul; CaCl 2 (1,0 M), 160-240 ul. Kulturen sind für SD 21 bis 35 Tagen in vitro verwendet. Vitality Verifikation. 3,6,7 Die Kulturen werden zum Nachweis von pyramidaler Neuronen Tod vor Gebrauch untersucht. Bei 18 Tagen in vitro, sind Einsätze für 20 min in Medium (unter normalen Inkubationsbedingungen) mit 5 uM Sytox Green, ein Marker, die fluoreszierende, wenn es um DNA (dh durch Eindringen in tote Zellen) bindet sich inkubiert. Einsätze sind dann zurück zu ihrem früheren Medium überführt und untersucht mit Fluoreszenzmikroskopie (504 Anregung und 523 emission) zum Nachweis von CA3 oder CA1-Pyramidenzellen Neuronenschicht Verletzungen. Scheiben mit mehr als 20 Zellen oder ein standardisiertes Niveau der Fluoreszenz von mehr als 250 IU wurden von der weiteren Verwendung ausgeschlossen. Werkstoffe Fertigung. Masse-Elektroden sind mit Glasröhrchen (2,0 mm OD / 1,16 mm ID) schneiden auf 4,5 mm Längen und kurz feuerpolierte an beiden Enden. Wir machen etwa 20 Elektroden in einer Zeit, die für mehr als ein Jahr dauern kann. Bringen Sie 100 ml 1M KCl zu kochen und hinzufügen, unter Rühren 3,5 g Agar und 0,5 g EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat), um eine klare gelbe Lösung herzustellen. Verwenden Sie ein kurzes Stück Schlauch über die einzelnen Glasrohr an warmen KCl / Agar-Lösung in die Glasröhren sowie ein kurzes Stück in den Schlauch zu ziehen. Release-Saug-und damit der KCl / Agar langsam aus Tropf der offenen Spitze aus einem Glasrohr, dann halten Sie die offenen Glasröhre Spitze gegen ein Stück Eis. Letztere Manöver wird die Agar-Gel prompt an die Spitze der Elektrode und nicht Gel nach Rückzug zurück bis in das Glasrohr. Sobald der Agar in das kalte Wasser geliert ist, kann der Schlauch ohne Veränderung der Agar in den Glasröhren positioniert entfernt werden. Legen Sie 0,5 ml 1 M KCl in jede Vertiefung einer 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen Rack. Dann legen Sie einen Tipp für jeden KCl / Agar gefüllten Glasrohr in einzelnen Vertiefungen. Danach halten Sie eine 80 cm Länge von 15 gauge Silberdraht mit einem hemostat und sauber jede der vier Seiten durch Abkratzen der Draht durch eine Emery Board statt, um die Zähler nach oben. Schneiden Sie den Draht in 4 cm Länge und legen Sie sie in ein Szintillationsfläschchen mit Bleichmittel für 20-30 Minuten gefüllt, um einen festen Ag-AgCl Schicht über die metallischen Oberflächen statt. Biegen Sie jeden Draht in der Mitte und legen Sie die freien Enden in das eine Ende der Glasröhre gefüllt with KCl / Agar, so dass etwa 4-6 mm ausgesetzt. Schließlich Beschichtung der Glasröhre Schaft mit dem Silberdraht und einem kleinen Teil des Drahtes mit Goop, eine wasser-und flexible Kleber, der KCl / Agar vor dem Austrocknen zu verhindern. Wiederholen Sie dies für alle Elektroden. Lassen Sie den Kleber über Nacht trocknen. Bewahren Sie die Elektroden bei 4 ° C in Szintillationsgefäße (5-6 Elektroden / Flasche) mit ca. 5 ml 1 M KCl und 25 mg EDTA, die sich deutlich verlangsamt das Wachstum von Bakterien. Borosilikatglas Rohre mit Filamenten (Video Abbildung 1); Recording-Elektroden sind aus 1,5 mm Durchmesser (10 cm Länge 0,86 mm ID) hergestellt. Pull Mikroelektroden zu einer feinen Spitze mit kurzen Glasröhrchen gezogen, um eine scharfe Spitze. Wir ziehen in der Regel Elektroden ~ 7,5 cm in der Länge mit einem 1 cm Konus. Dies ermöglicht adäquate Positionierung und Elektrodenspitze Visualisierung. Die Elektroden sind mit einem Narishige PE-2 Abziehers. Mikroelektroden-Tipps sind wieder auf 2-4 um unter Sicht mit einem zusammengesetzten Mikroskop mit einem kalibrierten optischen Mikrometer ausgestattet gebrochen. Wir verwenden den Rand eines Standard-Glas-Histologie Rutsche (25 x 75 x 1 mm), die an einer hydraulischen eindimensionalen Mikromanipulator von einem anderen 3-dimensionalen Manipulator sanft brechen die Mikroelektroden-Tipps statt. Zunächst wird die Elektrode montiert an einem Objektträger mit Ton. Dann wird die Folie auf dem Objektträger Halter, der verwendet werden, um die Mikroelektroden-Spitze in der Nähe der Kante des Glases zu bewegen geschoben, um die hydraulischen Manipulator befestigt ist, gelegt. Schließlich ist die Spitze der Mikroelektrode sanft, indem sie sich gegen die hydraulisch angetriebene Objektträger Kante gebrochen. Stimulationselektroden sind wire bipolare Elektroden, weil twisted: Sie ermöglichen die Aufnahme von evozierten Potentialen Feld, die sonst durch den Reiz Artefakt aus monopolare Stimulation verdeckt werden würde. Eine bipolare Stimulationselektrode kann leicht zum Gyrus dentatus Oberfläche ohne Schaden angewendet werden, im Gegensatz zu scharfer Spitze bipolaren Elektroden. Schließlich angelegten Strom ist es, die quer (bare) Kreisflächen der Teflon isolierte Drähte für die Elektrode verwendet lokalisiert. Stimulationselektrode Herstellung beginnt mit Schneiden ~ 20 cm Länge aus Platin-Iridium (125 um nackte Durchmesser, 200 um beschichtet Durchmesser) und Teflon beschichteten Draht. Dann biegen Sie die Länge in der Mitte und binden Sie die losen Enden zu einem lockeren Kreuzknoten, wobei ~ 2 cm aus dem Knoten an den Enden des Drahtes. Sichern Sie den Knoten in das Spannfutter einer Bohrmaschine auf einen Tisch gestellt. Halten Sie das andere Ende des Drahtes mit einem hemostat, kurz auf den Bohrer auf und ab, bis der Draht eng verdrillte (Das bedeutet, jeder Schnittfläche würde in gleichem Abstand von den anderen, wenn der Draht in Querrichtung ohne Entwirrung geschnitten werden ). Als nächstes müssen die blanken Enden der Platin-Iridium-verdrillte Leitungen zu verbundenen Drähte verwendet werden, um die stimulierenden Elektrode auf einen Stimulus Isolator Verbindung führen. Dies ist durch Löten die freien Enden der Platin-Iridium-Draht auf ~ 50 cm 30-Gauge-Kabel erfolgen. Zunächst Band die Platin-Iridium-Draht verdrillt, um eine Bank top-and-Drop eine Pfütze von konzentrierter HCl auf einen freien Ende des verdrillten Drahtes. Als nächstes ausziehen ca. 1 cm der Isolierung von jedem Draht mit einem Seitenschneider. Legen Sie das abisolierte Ende auf einem Leitungsdraht neben dem twisted wire Ende und wenden Wärme aus einem spitzen Lötkolben, Lötzinn dann, bis die beiden Drähte fest angebracht sind. Slip eine kleine Länge der Schrumpfschlauch über den freiliegenden Draht-Anschluss und schrumpfen sie mit Wärme zu passen. Wiederholen Sie dies für den zweiten Draht. Feuer Politur der Spitze eines 15 cm Pasteurpipette und führen den twisted Platin-Iridium-Draht auf der Pipette bis etwa 6 cm von der verdrehten herausragt. Verwenden Sie eine wasserabweisende Epoxid (zB JB Weld) an beiden Enden der Elektrode zu versiegeln. Schließlich legen Bananensteckern an den Litzenenden für den Anschluss an den Stimulus Isolator. Unter stereoskopische Betrachtung, statt die Spitze der Elektrode in PBS und suchen elektrolytisch erzeugten Blasen aus nur das abgeschnittene Ende der Elektrode Tipps. Wenn keine Blasen an den Seiten des verdrillte Leitungen kommen, schneiden Sie die Elektrode mit einem Schnitt quer mit einem frischen einzigen Rasierklinge wieder herzustellen intakte Isolierung, um den Draht langen Achsen. Bei der Fehlersuche zu abweichenden Reiz Wirkungen zu beheben, versuchen, einen frisch geschnittenen Elektrodenspitze. Recording Gerichte bestehen aus alsLäuse Kultur einfügen in einer 35 mm Kulturschale, die auf zwei 1,0 x 12 mm Glasstäbe Abstand von etwa 1,0 cm auseinander setzt. Bringen Sie Glasstäbe, die Schüssel Basis durch Erhitzen der Glasröhren und dann drückte sie in den Sockel mit einer Pinzette. Für statische Aufnahmebedingungen, fügen Sie 1,5 ml Medium, um die Schale. Anschließend tauchen Sie ein ~ 10 mm breit und 3-4 cm langes Stück sterile Baumwolle in 1,0 ml Medium. Falten Sie die Baumwolle in der Hälfte entlang der langen Achse und legen Sie sie entlang der inneren und auf den Einsatz mit einer sterilen Pinzette. Die nasse Baumwolle hilft bei der Erhaltung Gericht Luftfeuchtigkeit. Drei kompressiblen 4 mm Rohrlängen sind gleichermaßen um den Einsatz herum angeordnet. Decken Sie die Schüssel fest mit Polyvinylchlorid-Film, der den Gasaustausch ermöglicht. Cut um seine Mitte senkrechte Wand mit einer einzigen Rasierklinge, um überschüssige Polyvinylchloridfolie entfernen. Elektrophysiologische Setup Ein Stück Kultur einzufügen Assembly wird in die PDMI Aufnahme Kammer für elektrophysiologische Aufzeichnungen gespeichert. Der Einsatz / Kulturschale Montage in der PDMI Kammer wird durch eine 2 mm dicke Kunststoff-Scheibe mit dem PDMI Kammer zugeführt bedeckt, mit verschiedenen kleinen Löcher positioniert Bedarf für Aufnahmen Elektroden, mittlere Mittelzufluss /-abfluss Rohre, etc. Wir periodisch überwacht Medium pH mit einer Miniatur-pH-Einstabmesskette und Temperatur mit einem Miniatur-Typ T Thermoelement-Sonde in einem versiegelten semi-Mikroelektroden montiert auf 7,3 pH und 36,0 ° C zu gewährleisten. Der Einsatz / Kammer ist mit 5% Kohlendioxid-Bilanz Luft und Medium ist entweder statisch gehalten oder in eine Strömung (1,2 ml / min)-Konfiguration mit dem Einsatz Zentrum bei 35-36 ° C gehalten belüftet Für Strömungsverhältnisse, ist mittelgroß mit einem Durchlauferhitzer erwärmt, wieder in die Mitte der Aufnahme Kammer bei 36 ° C zu halten Eine peristaltische Pumpe mit einer Druckentlastung bringt Medium in der Scheibe Kulturen ohne Pulsationen der Pumpe. Ein Aspirator mit dem PDMI Kammer zugeführt wird verwendet, um mittelfristig aus dem Einsatz über sanfte Saugwirkung zu entfernen. Aus Stabilitätsgründen ist die Kammer auf einer speziell entwickelten Burleigh-Gibraltar inverse Mikroskop Bühne, die einem inversen Mikroskop hält und sitzt auf einem vibrationsfreien Tisch montiert. Kleine Löcher werden durch die Polyvinylchlorid einfügen Wrap mit einem kleinen, batteriebetriebenen Kauter Werkzeug geöffnet. Weiter, wenn eine Strömung Konfiguration verwendet werden soll, ist Einlass und Auslass fließen begonnen, gefolgt von Platzierung einer Masseelektrode. Ansonsten einfach die Masseelektrode statt. Elektroden, statt mit Mikromanipulatoren gehalten werden, werden direkt über eine Scheibe sichtbar gemacht mit einem inversen Mikroskop bei 5-facher Vergrößerung (Abb. 1) positioniert. Beginnen Sie mit der Aufnahme Elektrode durch die Stimulationselektrode gefolgt. Wir verwenden eine Audio-Monitor zu beachten, wenn die Mikroelektrode in Kontakt mit der Scheibe. Die Spitze ist in der Mitte entlang CA3 Pyramidenzellen Körper Schicht positioniert. Die Aufnahmen werden gestartet und dann der stimulierenden Elektrode wird sanft auf die Mitte Oberfläche des Gyrus dentatus berührt. In beiden Fällen sind erste Elektrode Bewegungen mit grobem Kontrollen durchgeführt und die endgültige Positionierung nur mit dem hydraulischen, feine Steuerung mit Phasenkontrast-Beleuchtung, so dass Zellkörper Schichten leicht unterschieden werden können. Advance-Elektroden in ~ 25 &mgr; Schritten unter direkte mikroskopische Visualisierung. Einmal Elektroden Gewebe berühren, vorab die Elektroden anderen 20-30 um. Die Aufnahmen werden begonnen, bevor der stimulierenden Elektrode geschaffen wird sicher zu sein, dieser löst keine SD (dh über einen mechanischen Reiz). ~ 10 Minuten verstreichen lassen, bevor Experimente gestartet werden. Transynaptically induzierte SD. Optimieren Sie evozierten CA3 Feldpotentiale wie folgt (Abb. 2). CA3 Feldpotential werden mit 100 us Impulse (0,2 Hz) beginnend mit einem Strom, der ausreicht, um eine Antwort (zB ~ 1-5 uA) Auslöser hervorgerufen. Bewegen Sie den Aufnahme-Elektrode in Schritten entlang der pyramidalen Neuronen langen Achse, bis das Feld Potenzial maximal ist. Dann, erhöhen Sie die aktuelle mit der Aufnahme-Elektrode an dieser Stelle und beachten Sie die maximale aktuelle Antwort (zB ~ 10-20 uA). Schließlich verwenden halbmaximale Reizintensität für Experimente (zB Schein-Kontrolle regelmäßige Stimulation). Bestimmen Sie die Schwelle für synaptisch evozierter SD (Abb. 2). Mit den Elektroden konfiguriert wie oben für evozierte Potentiale Feld umrissen, schalten Sie die Stimulation Paradigma auf einzelne, manuell ausgelöst platztvon 10 Impulsen (10 Hz bei 100 ms / Puls), ein Paradigma zuvor in ganzen Tierversuche angewendet. Schrittweise zu erhöhen Stromstärke pro Reiz Burst bis SD ausgelöst wird. Warten Sie mindestens 60-120 sec zwischen Reizen. Bericht SD Schwelle in Coulomb (dh Strom x Zeit). In anderen Experimenten, dass die Messung Antworten auf die Induktion von mehreren SDs benötigen, verwenden Sie eine Reizstärke wahrscheinlich SD hervorrufen (zB ~ 100-500 nC). Trigger-SD alle 9 min für eine Stunde. Achten Sie darauf, aseptische Techniken in Experimenten verwendet werden. Nach der letzten SD, Rückkehr der Kultur einfügen zu normalen Inkubationsbedingungen. Mark der Kulturschale, die Kultur, die SD erfahrene beachten. Unsere Gewohnheit ist es, eine einzige Marke auf der linken und zwei Marken auf der rechten Seite der Scheibe Kultur einzufügen Ort und stellt fest, jeder der drei Kulturen als # 1, # 2 und # 3 von links nach rechts. Ändern Medium alle 3-4 Tage bis Kultur zu ernten. Für immer wiederkehrende SD, folgen oben beschriebenen Verfahren. Wir in der Regel für einen Wechsel in SD Schwelle 1, 3, 7 und 14 Tage nach einer ersten Stunde mehrere SDs zu testen. CA3-Bereich schnell Potential und langsamen möglichen Änderungen werden über getrennte digitale Signalverarbeitung Systemen aufgezeichnet. 2. Beispielhafte Vital Imaging in hippokampalen Slice-Kulturen Dynamische funktionale Verhalten der ansässigen Immunzellen (zB Mikroglia) kann ebenfalls in Scheiben Kulturen ohne Zellschädigung oder Immunaktivierung (Abb. 3) überwacht werden. 9 Zum Beispiel zur Kennzeichnung von Mikroglia, ihre Bewegung mit synaptischen Aktivität Veränderungen der SD verbunden sind, bewerten, haben wir isolectin-IB 4 Fluorophor-markierten. "Lectin PBS" ist PBS mit zusätzlichen Kationen (0,1 mM jedes CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2), da zweiwertige Kationen (0.1-1.0 mM) erforderlich sind, um zu binden Lektin zu α-D-Galactosylreste auf Mikrogliazellen Zellmembranen. Machen Sie eine Lösung "Lectin PBS": Für 1 L PBS unter aseptischen Bedingungen und sterile Filtration, hinzuzufügen: 100 ul 1 M MgCl 2 100 ul 1M MnCl 2 100 ul 1M CaCl 2 Gründlich mischen zu kombinieren und zu halten, bei 4 ° C gekühlt Nur 500 ul der "Lektin PBS" pro Fläschchen isolectin nötig, aber da es sein kann, Kühl-und gehalten für Monate in einer Zeit, kann es sinnvoll sein, um sich größere Volumina. Rekonstituieren AlexaFluor 594-markierten isolectin-IB4 (isolectin) lyophilisierte Pulver zu 1 mg / mL in "Lektin PBS". Zur Minimierung Bleichen, führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich minimiert Belichtung. Isolectin zu 20 ul aliquotiert werden, sobald rekonstituierte bei 1mg/ml und bei -20 ° C bis zu einem Jahr. Verdünnen isolectin bis 20 pg / mL in Wachstumsmedium und inkubieren Scheibe Kulturen unter normalen Inkubationsbedingungen 4-10 Stunden vor der Bildgebung. Imaging Set-up. Imaging Set-up besteht aus: Mikroskop, Verschlusszeit, Kamera, Licht, 2,0 Graufilter, 36 ° C, Gas: 5% CO2, Luft (oder 20% Sauerstoff, Rest Stickstoff). Schalten Sie das Mikroskop, Kamera, UV-Licht-, Temperatur-Kontrolle und Gase mindestens eine Stunde vor Bildgebung. Set up MetaMorph Imaging Protocol. Aus dem "Journal" Drop-Down-Menü wählen Sie "Run Journal …". Dies sollte die Eröffnung der Zeitschriften-Ordner, aus dem Sie "Motion w-var afs (Journal zuvor festgestellt, dass folgende Schritte aus)" wählen sollten prompt, klicken Sie auf "Öffnen". Der "Autofokus Frequency"-Fenster wird bis nächsten Pop, halten Anzahl auf 1, klicken Sie auf "OK". Als nächstes wird das Setup "Sequential File Na …" Fenster öffnet sich, damit alles wie es ist: Base Name: Image; Bildnummer: 1; Anzahl Breite: 3; Save As Type: MetaMorph TIFF; wenn das Bild bereits vorhanden ist -> automatisch überschreiben; Klicken Sie auf "Select Directory …", dies bewirkt, dass die" Browse for Folder "-Fenster öffnet. Hier wählen Sie den Ordner (oder erstellen Sie einen neuen Ordner), wo der Film Bilder gespeichert werden sollen. Dann, wenn die richtigen Ordner (zB C: \ Data \ New Folder) ist in der Unterseite der Anzeige "Setup Sequential File Na …" Klicken Sie im Fenster "OK". In den Acquire Fenster: Wählen Sie die Einstellung in der linken unteren Ecke auf DiIMGBIN2 werden; "Exposure Time": 20ms; "Binning": 1. Dann, in der spezielle Registerkarte: "Sensor-Modus": FT; "Digitizer ": 10MHz (EM Gain); "Gain": Gain3 (3x); Wählen Sie "EM Gain: 45"; Kamera Shutter: Open for Expose; Clear Mode: CLEAR PRE EXP; Frei Graf: 2, Trigger Mode & Live Trigger Mode: Normal (ZEIT). "Frames Um Avg": 3. Klicken Sie auf "Schließen". Nach dem Einrichten der MetaMorph Imaging, statt den Einsatz in einer 35-mm-Kulturschale mit zwei 1 mm Glasstäbe in den Boden. Platzieren Sie drei 2 mm Stück Gummischlauch zwischen den Wänden des Einsatzes und der Kulturschale ausgestattet zur weiteren Stabilisierung des einzufügen. Legen Sie eine ca. 10 mm breites Stück aus Baumwolle in einer zusätzlichen 1 ml Medium im Inneren des Einsatzes getränkt, um eine feuchte Umgebung aufrecht zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass es bündig mit den Wänden und weg von den Schnitten des Hippocampus ist. Decken Sie die Oberseite der Kulturschale eng mit Polyvinylchloridfolie zu Flüssigkeitsverlust zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass der Fokus der Bildgebung der CA3 Pyramidenzellen Schicht ist. Beachten Sie die Scheibe der Orientierung, indem Phase Bilder zu 5x, 10x, 20x und. In der "Find Focus"-Fenster auf dem Bildschirm angezeigt wird, legen, Strom + / – als "8" und Genauigkeit, in Mikron (s), auf "1" (beide Boxen am unteren Rand sollte überprüft werden) . Klicken Sie auf "Find Focus" zu einem in-focus Bild zu gewährleisten. In der "Acquire Timelapse" Fenster, wählen Sie Zeitspanne zu sein "1 Minute", und die Dauer bis "6 Stunden" (das sind unsere bevorzugte Aufnahme-Parameter) werden. Um genau zu erfassen Mikroglia Bewegungen sollten Imaging nicht weniger häufig als einmal pro Minute. In Bildspeicherung, wählen Sie Stack. Die Update-Image Window-Box sollte überprüft werden, nicht aber die anderen beiden Feldern unterhalb. Wählen Sie "Illum" auf "Lambda" werden. Klicken Sie auf "OK". Der Film beginnt nun zu laufen. Dies bedeutet, dass nichts anderes kann innerhalb der MetaMorph Programm, bis der Film fertig oder bis Sie den Film schon, indem Sie Esc, nach dem der Film dann bei der nächsten zeitgesteuerten Erwerb Schritt stoppt durchgeführt werden. Am Ende des Films, für die Zellschädigung Prüfung durch Sytox Screening wie oben (A) angegeben. 3. RNA-Extraktion für Low-Level Cytokine Signaling 11-15 Wir haben bereits vorgestellt detaillierte Anweisungen für die Erkennung von Low-Level-Zytokin-Signaltransduktion in Scheiben Kulturen mit qPCR und PCR-Array-Techniken. 6,7 Wir haben deutlich die Empfindlichkeit unserer Ansätze zur Zytokin-mRNA-Nachweis in Scheiben Kulturen verbessert und präsentieren diese Verbesserungen hier. Die Verbesserungen umfassen unser Ansatz, um Gewebe Ernte-und RNA-Isolierung, die Voruntersuchung von Proben für die Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α) zu ändern, und cDNA preamplfication, die ca. 6-mal empfindlicher als bisherige Techniken und sind zum Beispiel erlauben, den für die ersten Mal der Scheibe Kultur Interferon-gamma (IFN-λ)-Erkennung. 15 PCR Vorbereitung. Slice-Kultur zu ernten. Nach Experimenten, in Scheiben schneiden Kultur-Einsätze sind in 2-3 mL RNA später und unter Wasser bei 4 ° C für bis zu 3 Tage bis zur weiteren Verarbeitung. Zur Ernte, entfernen Sie überflüssige (dh alle Gewebe neben dem Hippocampus im eigentlichen Sinne) Gewebe mit einem Diamantmesser und heben Sie die Scheiben in einzelne RNase / DNase freies 1,5 ml Röhrchen mit 0,5 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit einer feinen Spitze malen Bürste. Spin-Proben (10.000 rpm x 1 min) in ein stereotypes Mode, so dass alle Scheiben auf der gleichen Seite der Rohre zu halten. Entfernen PBS Überstand und resuspendieren Probe in 500 ul TRIzol. Shop-Proben bei -80 ° C oder auf Eis zu halten, bis die RNA-Extraktion. RNA-Extraktion usingTRIzol mit dem RNeasy Micro Kit Ergebnisse in größere RNA-Ausbeute (Abb. 4) als die Verwendung des Kits allein. Thaw TRIzol-Proben und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Distanzieren Gewebe, indem die Proben nach oben und unten mit 1 mL gekippt pippetor und / oder Vortexen, bis festes Gewebe nicht mehr sichtbar ist. 100 l RNase-Free (RF) Chloroform und das Röhrchen 2-3 mal zu mischen. Inkubieren 3 min bei Raumtemperatur, Vortexen jedem min. Zentrifuge bei 13.000 rpm für 15 min bei 4 ° C. Überstand in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. Achten Sie darauf, Schnittstelle zu stören. Fügen Sie dem gleichen Volumen Raumtemperatur RF 70% Molekularbiologie Ethanol (~ 300 ul). Vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren ein paar mal. Fahren Sie mit den folgenden Schritten pro RNeasy Micro Kit Richtungen: Bewerben Probe an einen RNeasy Micro-Spalte in einer 2-ml-collectio platziertn Rohr. Zentrifuge bei 10.000 rpm für 15 sec, verwerfen Durchströmung. Wash RNeasy Säule mit 350 ul Puffer RW1. Zentrifuge bei 10.000 rpm für 15 sec, verwerfen Durchströmung. Fügen Sie 10 uL DNase 1-Stammlösung zu 70 ul Puffer RDD, vorsichtig mischen. Übernehmen 80 ul der DNase-Lösung direkt auf Membran und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Wash RNeasy Säule mit 350 ul Puffer RW1. Zentrifuge bei 10.000 rpm für 15 sec, verwerfen Flow-Through-und Rohr. Add 500 ul Puffer RPE auf RNeasy Säule. Zentrifuge bei 10.000 rpm für 15 sec, verwerfen Durchströmung. Add 500 ul RF 80% Molekularbiologie Ethanol RNeasy Säule. Zentrifuge bei 10.000 rpm für 2 min, Durchfluss-und Rohr zu verwerfen. Legen Sie RNeasy Säule in neue Schläuche mit den Kappen zu öffnen. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (dh, 14.000 rpm) für 5 min. Transfer RNeasy Säule zu einer RF Mikrozentrifugenröhrchen. Übernehmen 14 ul RF Wasser direkt auf die Membran. Zentrifuge bei 10.000 rpm für 1 min zu eluieren. Shop-Proben bei -80 ° C oder zum nächsten Schritten fort. RNA-Quantifizierung. Verdünnen RiboGreen 1:200 in RF 1x Tris-EDTA (TE)-Puffer. Bereiten Sie Hefe-tRNA, die als RNA-Standard verwendet werden. Working Aktie ist in -20 ° C bei 100 ug / mL gespeichert Verdünnen, um 1 pg / mL (10 l in 990 ul TE). Create-Standards wie folgt: Für 100 ng / ul, 100 ul, für 80 ng / ul, fügen Sie 80 ul tRNA und 20 ul TE, für 60 ng / ul, mit 60 ul tRNA und 40 ul TE, für 40 ng / ul dann werden 40 ul tRNA und 60 ul TE, für 20 ng / ul mit 20 ul tRNA und 80 ul TE, und für 0 ng / ul 100 l TE. Bereiten Sie Proben: Kombinieren Sie 99 ul TE + 1 ul-Probe. Run jede Probe in zweifacher Ausfertigung. Mit einer Multi-Kanal-Pipette, 100 ul der verdünnten RiboGreen pro Vertiefung. Pipette auf und ab zu mischen. Messen Fluoreszenz auf einem Teller Leser. Fluorescein (485 nm/535 nm, 0,1 sec) Programm. Exportieren der Ergebnisse in eine Excel-Tabelle. Bestimmen RNA-Konzentration. Graph Saugfähigkeit gegenüber RNA-Konzentration und eine Best-Fit-Regressionsgerade in Excel. Bestimmen Proben-RNA-Konzentrationen aus der Regressionsgleichung mit der Best-Fit-Strecke verbunden ist. Bestimmen RNA-Qualität. Ribosomale RNA band Integrität wird über Agarosegel (Abb. 4) gemessen. Obwohl es nicht praktikabel ist auf einen Bruchteil der jeweiligen RNA-Probe erhalten (seit = 1 pg der RNA erforderlich ist, und unsere Erträge sind klein) laufen, ist es eine gute Idee, regelmäßig ausgeführt werden einem denaturierenden Agarosegel auf eine exemplarische Probe als Beweis dafür, dass die Methode , wenn man es richtig macht, ergibt sich qualitativ hochwertige RNA (dh ohne Qualitätsverlust). Bereiten Sie ein 1% Agarosegel (für eine 100 ml Volumen). Reinigen Sie die Elektrophorese-Tank, Gelträger und Gel-Kämme gründlich mit RNase AWAY. Abwiegen 1 g von hochreinem Agarose in einen Kolben. Fügen Sie 83 ml RNase freiem Wasser und 10 ml 10x MOPS [3 – (N-Morpholino) propansulfonsäure] buffer und Mikrowelle bis Agarose gelöst und die Lösung klar ist (~ 3 min). Um 10x MOPS-Puffer machen Kombinieren 83,7 g MOPS, 13,6 g Natriumacetat und 3,7 g EDTA. Add 800 ml RNase freiem Wasser, mischen sich aufzulösen. Der pH-Wert auf 7,0 und füllen auf 1 L. Filter sterilisieren oder autoklavieren. Bei Raumtemperatur lagern, vor Licht geschützt. Lassen Sie Gel auf 55 ° C abkühlen und 7 ml 37% Formaldehyd (sollte dieser Schritt in einem Laborabzug durchgeführt werden). Gießen Gel in Gelträger und ermöglichen Gel in die Haube zu festigen. Bereiten Sie die RNA-Proben. RNA-Probenpuffer (500 ul, machen frisch). Kombinieren Sie 50 uL 10x MOPS, 250 ul Formamid, 90 ul 37% Formaldehyd, 108 ul RF H ​​2 O und 2 ul Ethidiumbromid (Stammlösung 10 mg / mL). Von 1-10 pg RNA, fügen Sie dem doppelten Volumen mit Probenpuffer, für drei-facher Verdünnung. Denaturieren bei 95 ° C für 5 min und dann auf Eis für 5 min kalt stellen. Spin briefly und laden Sie die vollständige Probe in Brunnen neben einer RNA-Leiter (add Loading Dye falls gewünscht). Elektrophorese Kammer füllen mit 1x MOPS-Puffer. Elektrophorese bei 50-75 Volt, bis Marker über 2/3rd die Länge des Gels migriert. Visualisieren Sie das Gel auf einem UV-Transilluminator. Stellen Sie sicher, dass es scharfe 18S und 28S ribosomalen RNA (rRNA) Bands, und dass die 28S-Band doppelt so intensiv wie die 18S-Band (Abb. 4). Degraded RNA wird eine verschmierte Aussehen, Fuzzy-Bands, oder nicht zeigen ein Verhältnis von 2:1. In der Regel nutzen wir optische Dichte auf Gesamt-RNA Qualität zu beurteilen. Obwohl nicht so empfindlich, UV-Spektrophotometrie über einen Nanodrop ist eine schnelle und kostengünstige Mittel zur Überprüfung RNA-Qualität. Geben Sie für optische Dichte (OD) 260/280 Ratio von 1,5-2,0. Denken Sie daran, dass die Lösung in die RNA resuspendiert (TE-Puffer gegenüber Wasser) wird die OD-Verhältnis auswirken. PCR-Aktivitäten. Pre-PCR Setup Design-spezifische Primer Mit NCBI ist Primerblast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ : Geben Sie die Ziel-Gens RefSeq Zugangsnummer. Geben PCR-Produkt Größe 70 bis 200 bp. Geben Sie einen Tm von 55-72 °, mit weniger als 5 ° Unterschied zwischen Vorwärts-und Rückwärts-Primer. Wählen Sie "Primer muss eine Exon-Exon-Übergang span", um genomische Hintergrund zu reduzieren. Aktivieren Spezifität überprüfen Rat RefSeq RNA-Datenbank zu gewährleisten, dass Primer nicht erkennen zusätzliche Ziele. Wählen Sie ein Primerpaar aus den Ergebnissen, dass die folgenden Kriterien erfüllt: 18-30 Basen lang. Weniger als 2000 Basen auseinander auf Ihrer Vorlage. 40-60% Guanin-Cytosin-Gehalt, um eine stabile Bindung der Primer-Template zu gewährleisten. Die Wahl eines Referenz-Gens. Nicht jede Referenz-Gen wird für Ihre experimentelle Aufbau. Jedes Mal, wenn ein neues Paradigma verwendet wird, sollte die Stabilität Ihres Verweis überprüft werden. Aus Gründen der Konsistenz, entschieden wir uns zu einer der vier Referenz-Gene auf dem RT 2 Profiler PCR Array zu verwenden. Eine gute Referenz-Gen sollte die folgenden Kriterien erfüllen: Seine Expression wird nicht durch das experimentelle Paradigma verändert. Es ist auf einem ähnlichen Niveau, dass der Ziel-Gen exprimiert. Um eine geeignete Referenz wählen: Bewertung der Literatur mögliche Kandidaten für eine stabile Referenz-Gen in Ihrem System zu identifizieren. Zum Beispiel haben wir getestet, Rpl13a, weil es wurde gezeigt, dass in Studien der Ischämie stabil. 11,12 Design-Primer wie oben erörtert (oder finden bereits validierten Primer für gemeinsame Referenz-Gene in einer Datenbank wie RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ). Optimieren Primer neben Zielgen-Primer (siehe unten). Bestimmen Sie, welche Kandidaten Referenz am stabilsten ist mit Software wie Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm), die eine Stabilität Wert für jedes Gen berechnet auf Basis der konzerninternen Varianz und wählt die Gen (e) mit den geringsten Ausdruck Variation über die Proben. Zum Beispiel ist Rpl13a eine optimale Referenz-Gen für SD (Abb. 4). Optimieren Primer. Um konsistente und zuverlässige Ergebnisse von qPCR haben Primer an bestimmte Kriterien der Reproduzierbarkeit, Sensitivität und Spezifität zu erfüllen. Am besten ist es, diese Parameter für jedes neue Primerpaar zu testen. Die Reproduzierbarkeit wird durch laufende technische Replikate getestet. Die Empfindlichkeit kann durch Leistung mit einer Standardkurve von aufeinanderfolgenden 4-fach-Verdünnungen beurteilt werden. Die Spezifität wird durch die Bestätigung ein einzelnes Produkt durch Schmelz-Kurven-Analyse und-Gelelektrophorese (Abb. 5) bestimmt. Führen Sie einen qPCR Platte auf die Qualität Ihrer Primer zu testen und die Konzentration der Primer verwendet werden. Unter Verwendung von cDNA aus Whole-Brain-RNA synthetisiert, erstellen Sie eine Standard-Kurve (Serie von aufeinanderfolgenden 4-fache Verdünnungen) wie folgt: 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256 und keine Vorlage (NTC) . Für jede Verdünnung, laufen 1 ul cDNA in Doppelarbeitte für jede Konzentration der Primer, (dh, 100 nm, 200 nm, 300 nm). Bestätigen Sie, dass technische geben konsequente Ct-Werte repliziert. Untersuchen Ct-Werte für die Verdünnungskurve. Zeichnen Sie die Ct-Werte gegen die Konzentration für jede der Verdünnungen. Der resultierende Graph sollte linear mit einem guten Korrelationskoeffizienten (dh> 0,95). Untersuchen Schmelzkurve, um das Vorhandensein eines einzigen Amplifikationsprodukt (dh einzelnen Peak) zu bestätigen. Wenn es mehrere Gipfel sind, oder die Gipfel nicht ähnlich sind, könnte dies bedeuten, Verschmutzung, Mispriming, Primer-Dimer-Artefakt, etc. (Abb. 5). Ein Höhepunkt in der NTC wird wahrscheinlich Primerdimere die leichter Form in Abwesenheit der Vorlage cDNA entsprechen, und sollte kein Problem sein. Bestätigen Schmelz-Kurve Daten durch die Lösung amplifizierten Produkte auf einem 1% Agarosegel. Bereiten Sie ein 1% Agarosegel (für eine 100 ml Volumen) Abwiegen 1 g Agarose in einen Kolben. Add 100 ml 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer und Mikrowelle bis Agarose gelöst und die Lösung klar ist. 1 L 50x TAE-Puffer besteht aus 2 M Tris-Base, 57 ml Eisessig und 0,05 M EDTA (pH 8,0). Verdünnen TAE Puffer 1x mit destilliertem Wasser (Endkonzentrationen: 40 mM Tris-Acetat und 1,0 mM EDTA). Lassen Sie Gel auf 55 ° C vor der Zugabe Ethidiumbromid zu einer Konzentration von 0,5 ug / mL cool. Gießen Gel in Gelträger und lassen Sie es bei Raumtemperatur fest werden. Zu laufen, statt Gel in Elektrophoresekammer mit 1x TAE gefüllt, Mähdrescher 10 ul der Probe aus dem qPCR-Platte mit 2 ul von 6x Loading Dye, gut mischen und laden in die Vertiefungen neben einem Molekulargewicht Leiter. Elektrophorese bei 50-150 Volt, bis Marker ein angemessener Abstand migriert haben, je nach der erwarteten Größe der cDNA-Produkt. Visualisieren Sie mit einem UV-Transilluminator. Bestätigen Sie, dass die amplifizierte PCR-Produkt von geeigneter Größe für Ihre Zielgruppe ist. Primer-Dimere werden rund 50 bp werden. Pre-Bildschirm für erhöhte TNF-α. Da TNF-α initiiert Entzündungsreaktionen in der Peripherie, vermuten wir, dies gilt auch für Gehirn wahr und nutzen ersten Screening für TNF-α mRNA als Marker der Scheibe Kultur Immunstatus (dh normal, Schein-und experimentellen Gruppen), bevor Sie fortfahren in voller PCR-Array-Analysen. Wenn eine normale und eine Schein-Kontrolle TNF-α-mRNA-Spiegel nicht innerhalb einer Interassay Bereich, in unserem Labor, Experimente (dh normal, Schein-und experimentellen Gruppen) gefunden werden verworfen und nicht in voller PCR-Array-Analysen vor. iScript cDNA-Synthese. Für jede RNA-Probe, kombinieren Sie die folgenden in einem PCR-Röhrchen: 4 ul 5x Reaktion mischen, 1 ul-Reverse-Transkriptase, 25 ng RNA und RF H ​​2 O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul. Vorsichtig mischen und Spin-down kurz. Inkubieren: 25 ° C, 5 min, 42 ° C, 30 min, 85 ° C, 5 min. Verdünnen 1:4 (mit 60 ul RNase freies Wasser). Lagerung bei -20 ° C oder auf Eis zu halten, bis bereit, innerhalb von Stunden zu verwenden. qPCR für TNF-α. Bereiten Sie einen Master-Mix für jedes Primerpaar. Kombinieren 12,5 ul iQ SYBR Grün, 1 ul Primer-Mix und 10,5 ul Wasser pro Probe. Für unsere beiden Rpl13a und TNF-α-Primer, 200 nM die optimale Konzentration. Passen Sie die Menge an Primer und das Volumen der waster wie nötig in ein 1,5 mL RF Mikrozentrifugenröhrchen und halten auf dem Eis, während dem Einrichten der Platte. Richten Sie eine qPCR-Platte mit Kontrollen / shams / Experimentals. Verwenden Sie 1 ul cDNA pro Probe in Doppelbestimmung für jedes Gen. ADD 24 ul des Master-Mix in jede Vertiefung und Pipette auf und ab zu mischen. Seien Sie sehr vorsichtig, um Blasen zu vermeiden, da sie mit der Fluoreszenz-Messungen stören. Run 40 Zyklen der PCR-Amplifikation: 95 ° C, 8.5min; 40 Zyklen: 95 ° C, 10 sec, 60 ° C, 30 sec, 72 ° C, 20 sec / Zyklus. Melt-Kurve: 55 ° C, 1 min, 80 Zyklen von 0,5 ° C-Schritten für je 10 Sek. ab 55 ° C. Analysieren von Daten (ΔΔCt Methode;. Abb. 4). 13 cDNA-Synthese für PCR-Arrays. Berechnen Sie Volumen (ul) für jede Probe auf 250 ng der RNA haben. Wählen Sie einen Betrag von RNA (100 ng bis 1 ug), die Sie konsequent aus Ihren Proben zu extrahieren. RT 2 First Strand Kit – gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz: Auftauen und Spin-down alle Reagenzien. Für jede RNA-Probe, kombinieren Sie die folgenden in einem PCR-Röhrchen: 250 ng der RNA, 2 ul des 5x genomischer DNA (gDNA) Eliminierung Puffer und Wasser zu einem Endvolumen von 10 ul. Vorsichtig mischen und Spin-down kurz. Inkubation bei 42 ° C für 5 min. Gefühlt auf Eis für 1 min. In der Zwischenzeit bereiten sich die reverse Transkription (RT)-Cocktail (pro Probe): Kombinieren 4 ul 5x RT-Puffer 3, 1 ul Primer und externe Kontrolle zu mischen, 1 ul RT-Enzym-Mix 3 und 3 l Wasser. Add 10 ul RT-Cocktail zu jeder Probe und vorsichtig mischen. Inkubation bei 42 ° C für 15 min. Die Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 5 min. Add 91 ul der RF H ​​2 O zu je 20 ul cDNA-Synthese-Reaktion (verdünnen, um ein Endvolumen von 111 ul). Gut mischen durch Pipettieren. Lagerung bei -20 ° C oder auf Eis zu halten, bis bereit, innerhalb von Stunden zu verwenden. RT 2 Profiler PCR-Array. Die folgenden Anweisungen folgen denen der Hersteller und sind hier erneut für die Bequemlichkeit. Bereiten Sie Reagenzien Auftauen und Spin-down alle Reagenzien. Bereiten experimentellen Cocktail: Kombinieren 1350 ul 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR Green Master Mix, 102 ul der verdünnten cDNA und 1248 ul der RF H ​​2 O auf ein Endvolumen von 2700 ul. Entfernen Sie vorsichtig PCR-Array aus versiegelten Tüte. Dispense Cocktail in einen Laden Reservoir. Add 25 ul in jede Vertiefung mit einem Multi-Kanal-Pipette. Sorgfältig verschließen PCR-Array Platte. Die Platte bei 10.000 rpm für 1 min bei Raumtemperatur. Auf Eis legen, bis PCR-Programm ist fertig. Führen Sie das entsprechende PCR-Programm für Ihre Maschine. iCycler: 95 ° C, 10 min 40 Zyklen: 95 ° C, 15 sec, 60 ° C, 1 min. Melt-Kurve: 55 ° C, 1 min, 80 Zyklen von 0,5 ° C-Schritten für je 10 Sek. ab 55 ° C Analysieren von Daten. Wählen Sie "Auto Berechnet" für die Baseline-Zyklen. Wählen Sie "User Defined" für Schwelle Position manuell eingestellten Schwellwert. In "Log View", festgelegten Schwellenwert in das untere Drittel der linearen Phase der Amplifikation Plot. Achten Sie darauf, halten Schwellenwert der gleichen quer läuft. Exportieren von Daten. Eingang in eine Excel-Datei. Hochladen, um SABiosciences PCR Array Data Analysis. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php Wählen Sie Verweis Genen – wir haben Rpl13a. Unsere Praxis ist: Bestätigen Ergebnisse mit mindestens einem doppelten PCR-Array. 3-fach Array Änderungen müssen nicht durch nachträgliche bestimmtes Ziel PCR-Amplifikation bestätigt werden. 6,7 Weniger als 3-fach Änderungen sollten durch spätere bestimmtes Ziel PCR-Amplifikation oder Verwendung von 2-3 PCR-Arrays (bestätigt werden, um 2x Änderungen zu bestätigen. DNA Vorverstärkung wird verwendet, um Ziele mit den erwarteten Ultra-Low-Expression (Abb. 6) zu analysieren. SABiosciences ist RT 2 Nano PreAmp cDNA-Synthese-Kit und Primermischungen sind für die Prä-Amplifikation von RNA für die Einstellung von kleinen Mengen (1-100 ng) der Proben-RNA ermöglicht eine vollständige PCR-Arrays laufen. Jeder Primer-Mix kann für die Verstärkung von 89 Gen-spezifischen cDNA Ziel Vorlagen mit minimaler Verzerrung. Wir haben dieses System als ein Mittel zur Verstärkung niedrige Signale wie IFN-λ zu einem nachweisbaren Niveau verwendet. RT 2 Nano PreAmp cDNA-Synthese-Kit – gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz: Auftauen und Spin-down alle Reagenzien. Für jede RNA-Probe, kombinieren Sie die folgenden in einem PCR-Röhrchen. 1-100 ng RNA, 2 ul des 5x gDNA Beseitigung Puffer und Wasser zu einem Endvolumen von 10 ul. Vorsichtig mischen und Spin-down kurz. Inkubation bei 42 ° C für 5 min. Gefühlt auf Eis für 1 min. </li> In der Zwischenzeit bereiten sich die RT-Cocktail (pro Probe). Kombinieren 4 ul 5x RT-Puffer 3, 1 ul Primer und externe Kontrolle zu mischen, 1 ul cDNA-Synthese-Enzym-Mix, 1 ul RNase-Inhibitor, und 3 l Wasser. Add 10 ul RT-Cocktail zu jeder Probe und vorsichtig mischen. Inkubation bei 42 ° C für 15 min. Die Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 5 min. Lagerung bei -20 ° C oder halten Sie auf dem Eis bis zum Gebrauch. cDNA-Amplifikation mit spezifischen Primern. Mischen Sie die folgenden in einem PCR-Röhrchen: 12,5 ul PCR Master Mix, 7,5 ul spezifische Primer und 5 ul unverdünnter cDNA. Run 12 Zyklen der PCR-Amplifikation. 95 ° C, 10 min. 12 Zyklen: 95 ° C, 15 sec, 60 ° C, 2 min. Halten Sie bei 4 ° C. Add 2 ul Nebenreaktion Reduzierstück zu jeder Probe. Bei 37 ° C für 15 min. Die Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 5 min. Add 84 ul RF Wasser zu je 27 ul cDNA Amplifikationsreaktion. Lagerung bei -20 ° C oder auf Eis zu halten, bis bereit, innerhalb von Stunden zu verwenden. Amplify einzelnen Gen-Targets mit SAB-Primer und SYBR Green Master Mix wie oben beschrieben. 4. Multiplexed Phosphoprotein Assays of Cytokine Signaling Mutliplexed Phosphoprotein-Assays dienen zur Zytokin-Ligand-Rezeptor-Signalkaskaden (Abb. 7) zu definieren. Bestimmen Sie Betrag von Gesamt-Protein in Scheiben Kulturen. Ernte schneiden Kulturen durch leichtes Anheben Scheibchen abgeschnitten von Einsätzen und in 1 ml kaltem (4 ° C) PBS. Zentrifugenröhrchen für 30 Sekunden und entfernen PBS. Legen Sie auf Trockeneis, bis Ende der Ernte. Lagerung bei -80 ° C. Homogenisieren Scheibe Kulturen für Gesamt-Protein-Assay. Bereiten Zelllysepuffer nach den Anweisungen des Herstellers. Add-Protease-Inhibitoren zu einem Gesamtvolumen von Puffer benötigt, um mindestens 200 ul Lysepuffer auf jede Scheibe Kultur statt. Zum Beispiel: + 20 ul von Faktor 1, 10 ul von Faktor 2, und 20 ul 500 mM PMSF in DMSO auf 4,95 mL Lyse-Puffer. Thaw Scheibe Kulturen in 200 ul Lysepuffer auf Eis. Ultraschallbad Scheibe Kulturen fünfmal in 1 sec Impulse und Ort sofort wieder auf Eis. Vortex Proben für 10 sek. Centrifuge Proben bei 4 ° C für 15 min bei 13.000 Umdrehungen pro Minute. Überstand in ein sauberes Röhrchen und halten auf dem Eis. Führen Gesamt-Protein-Assay. Bereiten Protein-Standards. Rekonstituieren Lager Rinderserumalbumin (BSA) nach den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Standards im Bereich von 0 bis 1000 pg / mL in hochreinem Wasser für die BCA-Protein-Assay verdünnt. Berechnen Sie Volumen der Arbeitszeit Reagenz benötigt nach der Anzahl der Stichproben und repliziert. Zum Beispiel: (8 Standards + 18 unbekannte Proben) x (2 Wiederholungen pro Probe) x (0,2 mL arbeiten Reagenz pro Well benötigt) = 10,4 mL Gesamtvolumen für alle Proben auf der Mikrotiterplatte geladen benötigt. Rund bis zu 12 mL Gesamtvolumen genug Volumen zu gewährleisten. Beim Mischen von Reagenz A mit Reagenz B für die Arbeiterklasse Reagenz, manche Trübung auftreten, sollte aber in Kürze verschwinden. Last 10 ul der Proben und Standards pro Vertiefung. Legen Sie 0,2 ml der Arbeit Reagenz in die Vertiefungen. Abdeckplatte mit Dichtband und schütteln für 30 sec zu mischen. Inkubieren Platte bei 37 ° C für 30 min. Coole Platte auf Raumtemperatur (ca. 10 min) vor dem Lesen auf einem Platten-Lesegerät bei 595 nm Wellenlänge. Konstruieren Sie eine Standardkurve unter Verwendung von Microsoft Excel mit gemessenen Extinktion vs erwarteten Konzentration. Ein guter Korrelationskoeffizient ist gleich oder größer als 0,98. Berechnen Proteinkonzentrationen in den Proben nach der linearen Gleichung aus der Standardkurve abgeleitet. Verdünnen Sie die Proben in Lysepuffer auf gleiche Mengen an Protein und bei -80 ° C bis zur Weiterverarbeitung bereit. Protein-Konzentration sollte 200 bis 900 pg / mL nach den Anweisungen des Herstellers liegen. Führen Multiplex Assay. Hinweis: Multiplex-Assays Phosphoprotein nehmen 2 Tage insgesamt zu ergänzen, mit 1 Stunde Ersteinrichtung und Laden von Platte durch eine Übernachtung Inkubator gefolgtBewährungszeit Schritt und zusätzliche Inkubation und Waschschritte des folgenden Tages. Karte, welche Brunnen enthält die Lysat nach Arbeitsblatt in Handbuch. Thaw homogenisiert Gewebeproben und Kit Lysaten bei Raumtemperatur und dann auf Eis statt. Bringen Sie alle Puffer und Reagenzien im Kit auf Raumtemperatur zur Verfügung gestellt (mit Ausnahme von Streptavidin und Perlen). Bereiten Perlen für Multiplex-Assays. Abdeckung Röhrchen mit gekoppelten Beads mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. Vortex Röhrchen für 5 sec und halten auf dem Eis. Verdünnen gekoppelt Perlen 1:50 in Waschpuffer. Jeder sollte gut 1 ul gekoppelt Perlen in 49 ul Waschpuffer mit einem Gesamtvolumen von 50 ul pro Well enthalten. Kalibrieren Sie die Vakuumapparatur. Waschen Sie die Platte mit 100 ul Waschpuffer pro Vertiefung. Schalten Sie Vakuum-und Absaugen überschüssige Flüssigkeit innerhalb von 2-5 sek. Wenn die vollständige Entfernung des Puffers dauert länger oder kürzer als 2-5 sec, passen Druckventil entsprechend. Trocknen Sie die Unterseite der Platte gründlich, bevor Sie Proben. Vortex der verdünnten gekoppelt Perlen für 5 sec und 50 ul an bestimmte Brunnen. Unmittelbar Vakuumfilter und trocknen Sie die Unterseite der Platte mit einem Papiertuch. Waschen Sie die Platte zweimal mit 100 ul Waschpuffer pro Vertiefung. Trocknen Sie die Unterseite der Platte nach jeder Wäsche. Vortex aufgetauten Proben für 3 sec und 50 ul an bestimmte Brunnen. Legen Sie Dichtband über Platte und inkubieren 15-18 Uhr Schütteln bei 300 rpm bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Vakuumfilter überschüssige Flüssigkeit und waschen Platte dreimal mit 100 ul Waschpuffer. Trocknen Sie die Unterseite der Platte nach jeder Wäsche. Verdünnen Nachweisantikörper 1:25 in Waschpuffer. Jedes der gut erfordert 1 ul Nachweisantikörper in einem Gesamtvolumen von 25 ul Waschpuffer. Legen Sie Dichtband auf der Platte und vor Licht schützen mit Alufolie abdecken. Schütteln für 30 sec, allmählich zunehmender Geschwindigkeit bis 1100 Umdrehungen pro Minute. Weiter Schütteln bei 300 rpm für 30 min bei Raumtemperatur. Vakuumfilter der Platte und dreimal mit 100 ul Waschpuffer. Trocknen Sie die Unterseite der Platte nach jeder Wäsche. Während der Schutz der Platte vor Licht, Vorbereitung einer 1:100 Verdünnung von Streptavidin-PE mit genügend Volumen auf 50 ul pro Well hinzugefügt. Protect-Lösung von Licht. Vortex gründlich und 50 ul verdünnt Streptavidin-PE pro Vertiefung. Inkubieren unter Schütteln bei 1100 rpm für 30 sec, gefolgt von 10 min bei 300 Umdrehungen pro Minute. Vakuumfilter überschüssige Puffer aus. Waschen Sie die Platte dreimal mit 100 ul Resuspensionspuffer pro Vertiefung. Trocknen Sie die Unterseite der Platte gründlich nach jeder Wäsche. Add 125 ul Resuspensionspuffer um jede Kavität für 30 sec bei 1100 Umdrehungen pro Minute. Unmittelbar lesen Platte oder lagern bei 4 ° C, vor Licht für bis zu 24 Stunden. 5. Imitieren und Modulation der Cytokine Signaling Rekombinante Zytokin-Proteine ​​(mit Träger) werden verwendet, um Veränderungen von SD zu imitieren. Lyophilisierte Proteine ​​(zB TNF-α) sind für bis zu 1 Jahr bei -20 ° C gelagert Nach Verdünnen auf eine Stammlösung mit 0,1% Rinderserumalbumin, Aliquots hergestellt, gelagert bei -20 ° C bis zur Verwendung innerhalb von 3 Monaten. Manipulationen zu schneiden Kulturen aktualisiert mindestens jeden dritten Tag. Cytokine Signaling wird durch Schweigen: Verwendung von traditionellen Zytokin-Signalkaskade pharmakologische Wirkstoffe; Einsatz von löslichen Ligand-Antagonist [zB lösliche TNF-Rezeptor 1 (wie oben für die rekombinante Liganden beschrieben)], oder Gene Silencing [dh small interfering RNA (siRNA)]. Lieferung der siRNA zu neuronalen Zellen ist oft problematisch. Gemeinsame Lipid-basierte Reagenzien in der Regel in geringen Transfektionseffizienz und der Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen führen. Stattdessen verwenden wir Thermo Scientific ist Dharmacon Accell siRNAs, die für eine hohe Effizienz knockdown ermöglichen, ohne Verwendung eines Transfektionsreagenz. Hier zeigen wir Knockdown von Cyclophilin B, eine nicht-essentielle Protein in allen Zelltypen exprimiert, als Bestätigung der Anwendung dieser Methode in Scheiben Kulturen. Lieferung Protokoll wurde für Stück Kulturen aus den Anweisungen des Herstellers für den Einsatz in anhaftenden Zellen angepasst. Verdünnen Sie 5x siRNA Puffer 1x mit RNase freiem Wasser. Bereiten Sie eine 100 &mgr; siRNA-Lösung in 1x Puffer Cyclophilin B siRNA ist bei 5 nmol zur Verfügung gestellt. Resuspendieren in 50 ul 1x Puffer für eine 100 uM Lager. Mix siRNA mit Accell Lieferung medium bis zu einer Endkonzentration von 1 &mgr; siRNA. Zzgl. 11 ul 100 uM Lager siRNA bis 1100 ul von Accell Fördermedium in einer 6-Well-Platte. Legen Sie in den Inkubator und erlauben Temperatur auf den normalen Inkubationsbedingungen für mindestens 20 min äquilibriert. Mit Hilfe eines BSL-2 Kapuze und sterile Technik, Transfer-Einsätze in der Lieferung Mix-haltigen Brunnen. Inkubieren mit der Lieferung Mischung für 96 Stunden für Protein Knockdown. Beurteilen Protein Knockdown mittels Western Blot oder intensiviert Immunfärbung. Western Blots, während eine mögliche erste Wahl für Knockdown Effizienz, vielleicht zu unsensibel für die Low-Level-Immun-Signalisierung mit dem nicht schädigenden Phänomen der SD verbunden. Dementsprechend haben wir negative Western-Blot-Messungen mit Silber verstärkt Diaminobenzidin (DAB) Immunfärbung und computer-basierte Densitometrie Messungen (siehe unten). 6. Proteomic Bestätigungen Zell-Spezifität von Phosphoprotein Änderungen erfolgt über Immunfärbung. 6,7 Fix Scheibe Kulturen für 24 Stunden mit PLP Fixativ, bestehend aus: 10 mL 16% Paraformaldehyd, 1,096 g Lysin, 0,42 g Natriumphosphat und 0,17 g Natrium-Perjodat, auf ein Gesamtvolumen von 80 mL mit Reinstwasser (Fixativ beträgt 6,2 pH) gefüllt. Nach 24 Stunden, entfernen Scheibe Kulturen aus den Einsätzen mit einem feinen Pinsel und Transfer zum PBS mit Natriumazid (100 mg / L) bis zu seiner Sektion. Dann inkubieren Scheiben mindestens 24 Stunden in PBS-20% Saccharose, geschnitten ganze Scheibe Kulturen bis 20 um Abschnitte, und montieren zu gelieren beschichtete Objektträger. Fluorescent Immunfärbung (zB für NFKB) erreicht wird wie folgt mit allen Schritten gekoppelt Schütteln bei ~ 50 min. Wash Scheibe Kulturen in 3 mL PBS dreimal für 10 min. Die Objektträger mit montierten 20 um slice Kulturen in Färbetrog mit ~ 40 mL PBS für alle Waschschritte. Wash Scheibe Kulturen in PBS dreimal 10 min pro Waschgang. Legen Sie ein paar Tropfen SFX Signal Enhancer auf Slice Kulturen und inkubieren in einer feuchten Kammer für 30 min. Inkubieren Scheibe Kulturen für 2 h bei 37 ° C mit Kaninchen-Anti-NFκβ Antikörper bei 1:100 in 0,75% verdünnt Triton X-100 in PBS. Pipette Antikörper-Lösung direkt auf Scheiben schneiden. Entfernen Sie Scheiben von Antikörper-Lösung und dreimal gewaschen in PBS für 10 min pro Waschgang. Inkubieren Scheiben bei Raumtemperatur für 1 Stunde in Ziegen-Anti-Kaninchen-AlexaFluor 594 Antikörper bei 1:50 in 0,75% Triton X-100 in PBS. Centrifuge AlexaFluor 594 Antikörper für 15 min bei 10.000 rpm für jeden Niederschlag, der in der Lösung gebildet werden können, zu entfernen. Dreimal in PBS, 10 min pro Waschgang. Dip Slides in destilliertem Wasser abspülen Salze aus PBS. Deckglas mit ProLong Antifade Medium und lassen Sie für mindestens 2 Stunden trocknen lassen, fern von Licht bedeckt. Visualisieren Sie mit traditionellen oder konfokalen (Abb. 7) Fluoreszenzmikroskopie. Protein Änderungen in der Produktion von siRNA Knockdown feinfühlig durch die Stärkung traditioneller DAB Immunfärbung 7 über Silber Intensivierung 16 und anschließende densitometrische Quantifizierung (zB wie hier für Cyclophilin B gezeigt) (Video Abbildung 2) beurteilt werden. Immunfärbung für Cyclophilin B folgt Standardverfahren für Hellfeld Bildgebung haben wir vor kurzem ausführlich, 7 mit: Anti-Maus-Cyclophilin B (1:100) für 24 Stunden bei 4 ° C; Gefolgt von Meerrettichperoxidase sekundären Antikörper Kennzeichnung (1:100); Und DAB-Visualisierung. f der DAB Reaktionen zu schwach, um digitale densitometrische quantification17 ermöglichen, können sie mit einer differenzierten Silber Verfahren nach Quinn und Graybiel intensiviert werden. 16 Rehydrieren Rutschen und anschließend gründlich waschen x 3 für 10 Minuten in hochreinem Wasser. Die Objektträger in hochreinem Wasser in einem Coplin Glas und warm bis 56 ° C. Bereiten ammoniakalischer Silbernitrat-Lösung (0,5%): Lager Ammoniumchlorid (25-30%) ist frisch verdünnt (1:1) mit hochreinem Wasser. Add Ammoniumhydroxid (~ 500-600 ul pro 100 ml) tropfenweise unter Rühren zu der 0,5% Silbernitrat-Lösung, die kurz wiederum wird trüb und dann zu löschen. Wärmen Sie die Lösung auf 56 ° C. Inkubieren Abschnitte für 10-12 min. Waschen Sie die Objektträger für 15 sec in hochreinem Wasser (diese und alle folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur mit Färbetrog getan). Dip Slides für 15 sec in 1% Natriumthiosulfat (Pentahydrat). Dip Slides für 15 sec in hochreinem Wasser. Tone die Folien für 2 min in 0,2% Goldchlorid. Tauchen Sie die Folien in hochreinem Wasser für 15 Sekunden. Setzen Sie die Dias bis 0,5% Oxalsäure für 2 min. Tauchen Sie die Objektträger für 15 sec in hochreinem Wasser. Behandeln Sie die Folien für 5 min in 5% Natriumthiosulfat. Waschen Sie die Objektträger gründlich in hochreinem Wasser, entwässern und Deckglas. Slides sind nun bereit für densitometrische Quantifizierung. 17 Alle Geräte, einschließlich Hellfeld-Beleuchtung, ist für mindestens 20 min vor der Belichtung aktiviert. Ganze Scheibe Kultur Abschnitte werden in 5-10x auf einem inversen Mikroskop abgebildet. Die Lichtintensität ist, um ein einheitliches Niveau (zB ~ 2,6 V) eingestellt und nicht in allen Bildaufnahmen geändert. Neutralfilter sind nach Bedarf zum Vollbild übertragen Lichtintensität auf ~ 1500 auf einem 12-Bit-Skala (0-4095), wobei "0" ist komplett schwarz und 4095 ist komplett weiß zu reduzieren. Digitale Bilder werden dann erfasst und elektronisch für alle (dh, Schein-Steuerung und experimentellen Proben) gespeichert, darunter ein Hintergrundbild abgeleitete Form einer Fläche von der Folie, ohne Scheibe Kultur Abschnitten. Das Hintergrundbild wird von allen Bildern (Schein und experimentell) und einer Fläche von Interesse (AOI) um jede Scheibe Kultur gezogen und transmittierten Lichtintensität registriert abgezogen. Bild Intensitätsbereich ist es, einen konstanten Bereich für alle Versuche eingestellt. Aus Gründen der Klarheit zum Ausdruck gebracht resultierende als eine relative Dichte im Vergleich zur Kontrollgruppe Ebenen (Abb. 8). 7. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1. Slice-Kultur elektrophysiologische Ableitung Paradigma. Recording Mikroelektrode wird zunächst in der CA3 Pyramidenzellen Neuronenschicht gelegt und dann eine bipolare Reizelektrode ist im Gyrus dentatus (DG) platziert. Abbildung 2. CA3 evozierte Feldpotentiale und synaptisch induzierte Spreading Depression. (A) Versuche beginnen mit der Bestimmung der Strom zum Standard-CA3 Region Feldpotential Antworten und dann halb-maximale Intensität wird verwendet, um CA3 Region hervorgerufen Feldpotentiale entlocken zu maximieren. Dies dokumentiert die Normalität des evozierten synaptischen Antworten zwischen Zubereitungen. Wenn ein Stück des Feldes exzitatorischen postsynaptischen Potentiale nicht mindestens 3 mV, sind Scheiben verworfen. (B) Als nächstes trans-synaptisch evozierter Schwelle für die Auslösung Spreading Depression festgestellt wird (rechts, langsame Antworten), während zur gleichen Zeit Feldpotentiale (links , schnelle Reaktionen) werden verwendet, zu dokumentieren, dass die Vorbereitungen gesund genug, um 10 Hz Stimulation (zB Amplituden der vertikalen Abweichungen in schnellen Potenzial Datensätze sind ähnlich) zu folgen. Abbildung 3. Mikrogliazellen Bewegung mit reduzierter synaptischer Aktivität. Evidence verbunden zeigt, dass Mikroglia-Filialen und erweitern einfahren mit erhöhten synaptischen Aktivität, sondern Fern-Bewegung dieser Zellen als Reaktion auf synaptische Aktivität nicht in unverletzten Gehirn beschrieben worden. Unsere Ergebnisse unter Verwendung von fluoreszierenden isolectin B4 Kennzeichnung von Mikroglia zeigen, dass ein Teil dieser Zellen lange Distanzen bewegen sich unter normalen Bedingungen. Darüber hinaus ist die Zahl dieser Reisen Mikroglia deutlich erhöht, wenn synaptischen Aktivität durch Kultur Exposition gegenüber Tetrodotoxin abgeschafft wird, wie in den beigefügten Bild zu sehen. Rote Linien markieren Pfade reiste durch Mikroglia über einen Zeitraum von 6 Std. mit blauen Pfeilen markiert den Ursprung der einige beispielhafte Mikroglia. Calibration bar, 50 pm. Abbildung 4. PCR-Screening-Aktivitäten. (A) Wir verwenden TRIzol zusammen mit Qiagen-Kits für RNA-Isolierung, da in unseren Händen, führt dies in signifikant höher (P <0,001; t-Test). RNA-Ausbeute aus hippocampalen Slice-Kulturen als die Verwendung von Qiagen Kits allein (B) In Darüber hinaus haben wir in regelmäßigen Abständen zu bestätigen, dass unsere RNA-Extraktion Verfahren qualitativ hochwertige intakte RNA produzieren, wie über ein Gel, das scharfe RNA-Banden zeigt, bestimmt. (C) Wir NormFinder Software verwenden, um eine Referenz-Gen mit einem beste Stabilität Wert zu wählen. Zum Beispiel, ausgesetzt Scheibe Kulturenzu lipopolyssacharide (100 ng / mL für 2 Std.) wurden für drei Referenz-Gene (Rpl13a, β-Aktin, 18s) analysiert. Ct-Werte werden verwendet, um eine Stabilität zu berechnen. Unsere Daten hier [und dass für andere Experimente mit Spreading Depression (Daten nicht gezeigt)] zeigen, dass Rpl13a eine optimale Referenz-Gen ist. (D) Wir verwenden die "ΔΔCt"-Methode als eine empfindliche und reproduzierbare Mittel, um fold-change RNA Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen und eine Schein-Kontrollen zu erkennen. Abbildung 5. PCR-Reaktion überprüft. (A) messen wir Verdünnungskurve Verstärkungen für Grundierungen als ein Mittel, um die Qualität der PCR-Reaktionen zu überprüfen. Zum Beispiel zeigen die optimale Verstärkungen eine einheitliche (1-5) Erhöhung der Schwellenwerte Ct. (B) Im Gegensatz dazu Verstärkungen nicht mit schlechten Primer (1-5) einheitlich. (C) Darüber hinaus haben wir eine Schmelze Kurve an der Durchführung Abschluss der PCR-Assays zu bestätigen, dass die gewünschten Amplikons erkannt werden (dh ein einzelner Peak-Kurve), die das Fehlen einer doppelsträngigen DNA mit Primer-Dimeren zeigt, kontaminierenden DNA und misannealed PCR-Produkt (das wäre als mehrere Gipfel Kurven erscheinen). Abbildung 6. Nano Vorverstärkung ermöglicht den Nachweis von IFN-λ in hippocampalen Slice-Kulturen. Da nur ~ 50 T-Zellen in ein Stück Kultur (von ~ 55,000-90,000 insgesamt Zellen) zu finden sind, haben wir die RT 2 nano PreAmp cDNA Synthesis Kit verwendet als ein Mittel, um potenzielle ultra-geringe Expression von IFN-λ zu erkennen. Dies bedeutet, der cDNA Vorverstärkung bot eine 12-fache Steigerung der Empfindlichkeit auf ein Niveau RNA. Die oben gezeigten Ergebnisse zeigen die Fähigkeit der Vorverstärkung zu Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Ct Schwelle für Referenz-Gen Rpl13a betrug 20,5 mit anfänglicher Verstärkung und dies war auf 14,1 mit der Nutzung der Vorverstärkung Kit, einem 12-fachen Anstieg entsprechend 12 Zyklen der PCR-Amplifikation von cDNA erhöht. Parallel dazu wurde IFN-λ nicht nachweisbar (0,0), wurde aber auch innerhalb Erfassungsbereich (29,0) mit Vorverstärkung. Abbildung 7. Angeborene Zytokin Weg Phosphoprotein Phosphorylierung verändert. (A) Beispielhafte Wirkung von TNF-α-Vorbehandlung (dh, Neuroprotektion) auf angeborene Zytokin Weg Phosphoprotein Phosphorylierung 24 Stunden nach excitotoxic Verletzungen in hippocampalen Slice-Kulturen. Die Ergebnisse zeigen, CA1-Bereich wechselt zwischen Scheiben für 3 Tage mit 100 ng / mL TNF-α vorbehandelt, bevor Exposition gegenüber N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) im Vergleich zu denjenigen ausgesetzt NMDA allein (dh experimentelle vs sham), ausgedrückt als Prozentsatz. Beachten Sie, dass TNF-α eine nachhaltige Steigerung der Phosphorylierung JNK und ATF-2 sowie ein vorübergehender Anstieg der NFKB induziert. (B) Die räumliche Verteilung der NFKB Aktivierung (dh Vorhandensein von phosphoryliertem NFKB im Kern) ist durch Immunfärbung zeigte ( rot). YoYo Flecken Kerne grün in ein Stück Kultur Abschnitt [zB in Astrozyten (Pfeilspitze)]. Pyramidalen Neuronen, die sonst auch erscheinen würde grün, sondern wegen der gleichzeitigen Markierung mit phosphorylierten NFKB (rot) gelb. Calibration bar, 25 um. Abbildung 8. . Proteomic Bestätigung der siRNA Effizienz Differenzierte Silber Intensivierung der Peroxidase-Diaminobenzidin Basis Immunfärbung für Cyclophilin B zeigt, dass siRNA kann signifikant (P <0,001; ANOVA-Holm-Sidak-Methode) zur Reduzierung der globalen Hippocampus Scheibe Cyclophilin B Ausdruck 3 Tage nach der Applikation von 200, 500 oder 1.000 nM siRNA.