De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie

1. Muis boord, spier voetstuk, body wig en superfusie oplossing Muis boord: Een transparante plexiglas rechthoekige bord (6 "breed X 8" lang x 3 / 16 "dik) is gemaakt om te passen op het podium van de microscoop The." Muis boord "is waar de verdoofde muis is beveiligd tijdens chirurgische voorbereiding van de de cremaster spier. Muscle voetstuk: Een transparante silastic rubber voetstuk wordt bereid uit Sylgard 184, dat wordt gemengd volgens de fabrikant ° S instructies. Een handige mal is een 15-mm dik x 50 mm diameter wegwerp petrischaal. De Sylgard blok wordt gesneden om de gewenste vorm met een scheermesje (zie figuur 1C.). Een dunne laag van duidelijke waterdichte silicone lijm wordt gebruikt om de Sylgard te blokkeren om de muis raad van bestuur veilig te stellen. Handige tips: Na het gieten van de Sylgard in de petrischaal, ontgassing in een vacuüm kamer voor een uur verwijdert luchtbellen en verbetert de helderheid. Na ontgassing, uithardingstijd voor Sylgard wordt verkort door het plaatsen van de schotel in een laboratorium oven op 50 ° C gedurende enkele uren. Lichaam wig en verwarming platform: A wig (2 "x 4" x 15 °) geplaatst onder de muis en tegen het voetstuk kantelt het lichaam naar voren dat vergemakkelijkt de uitbreiding van de cremaster spier boven de sokkel van zijn oorsprong. Het opnemen van een aluminium platform op het oppervlak zorgt voor geleidende warmte. Het platform wordt verwarmd door weerstanden aangesloten op een DC-voeding (figuur 1A). Kalibreren van het platform temperatuur tot ~ 40 ° C houdt slokdarmkanker temperatuur op ~ 37 ° C. Anders wordt stralingswarmte van een lamp wordt gebruikt. Pins. Om te zorgen voor de cremaster spier op het voetstuk, zijn de pinnen bereid uit 0,15 mm insect pinnen die zijn gebogen in een "L" vorm. Fysiologische zoutoplossing (PSS). De voorbereidingen zijn superfused (geïrrigeerd) continu met bicarbonaat-gebufferde PSS bereid in ultrapuur (18,2 MΩ) H 2 O. Stock oplossingen worden voorbereid op 20X uiteindelijke werk concentratie en gesteriliseerd door een 0,2 um filter. Stamoplossingen nog goed voor enkele weken indien bewaard bij 4 ° C. Voorbereiden zouten los van de bicarbonaat en mengen ze met verdunning op de dag van het experiment voorkomt dat de neerslag van calcium bicarbonaat. De voorraad zout-oplossing bestaat uit (in mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. De voorraad bicarbonaat is 360 NaHCO 3. Op de dag van een experiment worden respectievelijke oplossingen gebracht tot een uiteindelijk volume (normaal 2 L voor een bepaalde experiment) in een maatkolf en geplaatst in een waterbad van ~ 37 ° C. Equilibreren de PSS met 5% CO 2 / 95% N 2 voor ~ 15 minuten met behulp van een gas dispergeerinrichting past de pH tot ~ 7,4 en voorkomt neerslag. De PSS is voortdurend borrelen met 5% CO 2 / 95% N 2 in de hele experimenten. De uiteindelijke samenstelling van werkende oplossing (in mmol / L) is: 132 NaCl, KCl 4,7, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl2, 18 NaHCO 3. 2. Anesthesie en de voorbereiding voor de operatie Na goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite, worden mannelijke muizen ten minste 12 weken oud gebruikt. De muis is verdoofd met pentobarbital natrium (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) injectie. Een straatverbod buis blijkt nuttig voor het vastzetten van de muis tijdens de eerste injectie. Gedurende chirurgische procedures en experimentele protocollen, wordt verdoving onderhouden door supplementen (10-20% van de eerste injectie, ip) als nodig is (elke 30-60 minuten, aangeduid met terugtrekking reactie op teen of staart knijpen). Tip: Verdunnen de pentobarbital 10 mg / ml in steriele zoutoplossing voor injectie vermindert de mogelijkheid van een overdosis. Anesthesie compromissen temperatuurregeling, zodat de muis moet warm gehouden worden direct na de eerste injectie. Het plaatsen van de muis in een metalen drager (geventileerd aluminium mand) op de top van een verwarmingsplaat (gekalibreerd tot ~ 37 ° C) werkt goed. Als alternatief kan een warmte-lamp worden gebruikt en zorg ervoor dat positie op een gepaste afstand van de muis. De muis moet worden gecontroleerd elke 5-10 minuten, totdat het geschikte niveau van de anesthesie wordt bereikt (het ontbreken van terugtrekking tot teen of staart knijpen). Een aanvullende dosis kan nodig zijn na 15-20 minuten. Het is het beste om geduldig te zijn en met de nodige voorzichtigheid te gaan om overdosering te vermijden, vooral met overgewicht of oude dieren. Het haar wordt verwijderd uit de onderbuik, onderrug, scrotum en benen door het zorgvuldig scheren respectieve regio's. Bijzondere aandacht moet worden genomen om trauma te voorkomen het scrotum en de testikels, die anders zal verwonden cremaster spier. Verwijder de losse haren met een nieuw alcoholdoekje. Als de blaas vol is zal het voelen als een kleine druif door de buikwand. Leeg de blaas met behulp van zachte druk om de muis te voorkomen dat urineren op de cremaster voorbereiding tijdens de experimenten. Een Kimwipe is een effect spons om collectievet de urine. Plaats de muis op zijn rug, liggend op de wig met zijn benen aan weerszijden van het voetstuk. Een zijden hechtdraad (4-0 of 5-0) vastgebonden aan elke voet zorgt voor een ketting voor het beveiligen van de muis met zijn kruis tegen de sokkel. Een stuk van de tape losjes geplaatst over de borst en bevestigd aan de wig houdt algemene lichaamshouding. Chirurgische ingrepen worden uitgevoerd terwijl u door middel van een stereomicroscoop met microdissectie schaar en pincet schuin. 3. Chirurgische de voorbereiding van de open cremaster spier Een pin is geplaatst via de apex van de scrotum sac (de linker-of rechterkant) en vastgezet in het voetstuk om de spanning op de huid plaats. Superfusie met PSS (34-35 ° C) wordt gestart over de chirurgische veld en gedurende de gehele dissectie om de blootgestelde weefsel warm en vochtig. Een lont (gemaakt van Kimwipe) geplaatst met een uiteinde naast het scrotum sac en de andere naast een vacuüm lijn verwijdert het effluent PSS. Een kraal van siliconenkit gehandeld op grond van het plexiglas bord en volledig rondom de wig en het voetstuk dient als "gracht" aan een PSS dat niet is opgezogen verzamelen, die als een effectieve voorzorgsmaatregelen om PSS lekkage te voorkomen op de microscoop. Wordt een incisie gemaakt langs het ventrale oppervlak van de scrotum sac. Als de testikel is ingetrokken door de cremaster spier in de buikholte, zachte druk op de onderbuik leidt de testikel in de zak. Het oppervlak van de cremaster spier bovenliggende de testikel moeten worden geïdentificeerd op dit moment. Bindweefsel tussen het scrotum huid en de cremaster spier is zorgvuldig verwijderd om de cremaster spier vrij te zijn van het omringende weefsel. Het scrotum huid is zacht teruggetrokken achter de proximale rand van de sokkel en vastgezet aan beide zijden met een speld. Het buitenoppervlak van de cremaster spier oppervlak wordt dan vrijgegeven van bindweefsel. Continu superfusie tijdens dissectie hydrateert het bindweefsel, het vergemakkelijken van zichtbaarheid en verwijdering. Een pen door de apex van de cremaster spier wordt gebruikt om het te plaatsen onder longitudinale spanning. Een longitudinale incisie wordt gemaakt door de ventrale oppervlak van de spier met grote zorg genomen om verstoring van de bloedtoevoer te minimaliseren. Bloedstroom dynamiek in de buurt van de periferie van het preparaat worden gewijzigd door dit weefselschade 14. Dan ook, te minimaliseren om deze effecten op het verzamelen van gegevens, de bloedvaten dicht bij het centrum van de voorbereiding worden gebruikt voor de beeldvorming en fysiologische studies. De cremaster spier is verbonden door een dunne ligament aan de bijbal onder de testikel. Als gevolg van de testikel aan de ene kant blootstelt dit ligament, die zorgvuldig is gescheiden van de bijbal. De buurt van de top van de cremaster spier kleine slagader en ader aan te sluiten op de bijbal. Afsluitende deze schepen tussen de tang en trek ze uit elkaar minimaliseert bloeden. De teelbal, bijbal, testiculaire slagader en ader zijn proximaal afgebonden (4-0 of 5-0 zijden hechtdraad), afgehakte en weggegooid (orchidectomie) samen met de bijbehorende inguinale vet pad. Als alternatief kan de testikel terug te voorzichtig worden geduwd in de buikholte en behouden met een stukje katoen of Kimwipe. De orchidectomie dient om mogelijke trauma's te vermijden om het weefsel bij het duwen van de testes terug in de buikholte. We hebben niet gevonden opvallende verschillen in de kwaliteit van de cremaster microcirculatie voorbereiding (zie paragraaf 3.8) met behulp van de procedure 7,15. De buitenkant van de cremaster spier verwijdering van de resterende bindweefsel en vervolgens verspreid radiaal op het oppervlak van de sokkel. De randen zijn vastgezet met pennen (zie paragraaf 1.4) in 5-6 plaatsen om een ​​vlakke plaat van de dwarsgestreepte spier met intacte microcirculatie te creëren. Het ingevulde voorbereiding is overgebracht naar het stadium van een intravitale microscoop, superfused continu (3-5 ml / min, 34 ° C) en in evenwicht gedurende 30 minuten. De integriteit van de cremaster voorbereiding is de hand van verschillende criteria. Spontane vasomotorische toon met een minimale chirurgisch trauma wordt aangegeven door fikse stroming in arteriolen en een gebrek van het aanklevende leukocyten in venulen. De meest gevoelige index van een responsieve preparaat is vernauwing van de arteriolen aan het verhogen van de superfusie oplossing zuurstofgehalte gedurende 5-10 minuten. Dit wordt gedaan door equilibreren met 21% O 2 (tegenover 5% O 2; zie paragraaf 1.5, alle met 5% CO 2, balans N 2). De aanwezigheid van leukocyten in arteriolen, de afwezigheid van rode bloedcellen die via capillairen, en / of leukocyten zich ophopen in venulen en het omliggende weefsel zijn tekenen van weefselbeschadiging en ontsteking. 4. Intravitale beeldvorming van de cremaster spier microcirculatie Intravitale beeldvorming wordt uitgevoerd op een aangepaste microscoop op basis van een Olympus MVX10 Stereo Zoom platform. De MVX10 microscoop lichaamis gemonteerd op een MVX10 hybride stand uitgerust met transilluminatie (halogeen lamp) voor helderveld (Köhler) beeldvorming en met epi-verlichting (kwiklamp) voor fluorescentie beeldvorming. Met behulp van epi-verlichting, is GCaMP2 enthousiast op 472/30 nm met emissie verzameld op 520/35 nm. Beelden worden verkregen door middel van een MV PLAPO 2XC lens (numerieke apertuur = 0,50; Olympus) met behulp van een XR/Mega-10 geïntensiveerd digitale camera (Stanford Fotonica, Inc, SPI) via Piper Control Software (SPI) op een personal computer. Met dit systeem kan de waargenomen gezichtsveld (FOV) worden gevarieerd van 553 micrometer X 442 micrometer tot 22 mm X 18 mm. Na voltooiing van intravitale imaging experimenten, is het onder narcose muis inslapen met een overdosis pentobarbital, gevolgd door cervicale dislocatie. 5. Representatieve resultaten Figuur 1. Mouse bord voor intravitale beeldvorming van de muis cremaster voorbereiding. A) Body wig met aluminium platform (geïsoleerd met gele plastic) gezien vanaf de onderkant. Verwarmingsweerstanden bevestigd aan de onderkant van het platform uitgevoerd warmte. B) De verwarming platform rust op een kunststof wig. C) Het lichaam wig wordt geplaatst op een plexiglas bord voor de operatie en de daaropvolgende overdracht naar het stadium van de intravitale microscoop. Sylgard voetstuk wordt aangegeven met rode pijl. Een kraal van waterdichte silicone omringt de gehele voorbereiding aan een oplossing die kan lekken tijdens de intravitale procedure, te voorkomen dat het druppelen op de microscoop bevatten. Figuur 2. Custom MacroZoom microscoop voor groothoek beeldvorming. A) MVX10 microscoop body (Olympus) met XR/Mega-10 ICCD camera (Stanford Photonics) gemonteerd op trinoculaire poort. B) Close-up van de microscoop lichaam. (A) zoomfunctie (0,63 tot 6.3X), (b) filter wiel; (c) beeld verdubbelaar (NA = 0,50 met 25x optische vergroting). C) substadium condensor voor helderveld (Köhler) verlichting (condensor NA = 0.55, werkafstand = 27 mm). Figuur 3. Voltooide muis cremaster voorbereiding. Verdoofde muis in rugligging op warme geplastificeerd aluminium platform (geel). Lichaamshouding is beveiligd met tape. De cremaster spier is radiaal verspreid over de transparante silastic rubberen voetstuk en vastgepind aan de randen. Superfusie oplossing is geïntroduceerd op de proximale uiteinde door middel van een plastic druppelaar (witte pijl). Een vacuüm lijn (witte pijlpunt) verwijdert de oplossing via een Kimwipe lont. Twee micropipetten getoond gepositioneerd met hun tips in het weefsel. Een referentie-elektrode (zilver draad) is bevestigd aan de onderste rand van de cremaster spier. Figuur 4. Illustratie van de vergroting bereik voor het visualiseren van netwerken arteriolaire uiten GCaMP2 in endotheel. A) TL en B) helderveld foto genomen op een optische vergroting van 3,2 x voor een totale vergroting = 42X op de video-monitor. [Field of view (FOV) = 4375 x 3470 um]. Schaalbalk = 500 pm. Werken bij deze vergroting vergemakkelijkt het plaatsen van micropipetten op de gewenste locaties. C) TL-en D) helderveld foto genomen op optische vergroting van 6.4X voor een totale vergroting = 83X (FOV = 2200 x 1759 um). Schaalbalk = 200 micrometer. E) TL-en F) helderveld foto genomen op optische vergroting van 12.6X voor een totale vergroting = 165X (FOV = 1100 x 885 um). Schaalbalk = 100 micrometer. G) Met afbeelding doubler, optische vergroting = 25.2X. Schaalbalk = 50 pm.