Relação custo-benefício Método de Rastreamento Fonte microbiana, utilizando específicas Vírus Humano e Animal
Summary
O estudo descreve um método de baixo custo para a identificação da fonte de contaminação fecal / urinária ou contaminação por nitratos na água usando qPCR para a quantificação específica de vírus de DNA humano / suínos / bovinos, adenovírus e polyomaviruses, propostos como ferramentas de MST.
Abstract
Contaminação microbiana do ambiente representa um risco significativo à saúde. Clássica bacteriana fecal indicadores têm mostrado ter limitações significativas, os vírus são mais resistentes aos processos de inativação muitos e padrão de indicadores de contaminação fecal não informar sobre a fonte de contaminação. O desenvolvimento da relação custo-eficácia dos métodos para a concentração de vírus a partir de água e ensaios moleculares facilita a aplicabilidade de vírus como indicadores de contaminação fecal e como fonte microbiana de rastreamento (MST) ferramentas. Adenovírus e vírus de DNA são polyomaviruses infectar espécies de vertebrados específicas, incluindo os seres humanos e são persistentemente excretados nas fezes e / ou urina em todas as áreas geográficas estudadas. Em estudos anteriores, sugerimos a quantificação do adenovírus humano (HAdV) e polyomaviruses JC (JCPyV) por PCR quantitativo (qPCR) como um índice de contaminação fecal humano. Recentemente, desenvolvemos ensaios qPCR para a quantificação específica de Poradenovírus cine (PAdV) e polyomaviruses bovina (BPyV) como animal de contaminação fecal marcadores com sensibilidades de cópias do genoma 1-10 por tubo de ensaio. Neste estudo, apresentamos o procedimento a ser seguido para identificar a fonte de contaminação em amostras de água utilizando essas ferramentas. Como exemplo de resultados representativos, análise de vírus em águas subterrâneas que apresentem níveis elevados de nitratos é mostrado.
Detecção de vírus em baixa ou moderada águas poluídas exige a concentração do vírus, pelo menos, vários litros de água em um volume muito menor, um procedimento que geralmente inclui duas etapas de concentração em série. Este procedimento um pouco pesado ea variabilidade observada em recuperações viral significativamente prejudicar o processamento simultâneo de um grande número de amostras de água.
A fim de eliminar o gargalo causado pelos procedimentos de duas etapas que temos aplicado um protocolo um passo desenvolvido em Studie anteriors e aplicável a uma diversidade de matrizes de água. O procedimento inclui: acidificação das amostras de dez litros de água, floculação por leite desnatado, sedimentação por gravidade dos materiais floculados, a coleta do precipitado e centrifugação, ressuspensão do precipitado em 10 ml de tampão fosfato. O concentrado viral é usado para a extração de ácidos nucléicos virais e os adenovírus específicas e polyomaviruses de interesse são quantificados por qPCR. Elevado número de amostras pode ser simultaneamente analisadas por este método de concentração de baixo custo.
O procedimento foi aplicado para a análise das águas balneares, água do mar e água do rio e, neste estudo, apresentamos os resultados da análise de amostras de águas subterrâneas. Este método de alto rendimento quantitativo é confiável, simples e rentável.
Protocol
Discussion
O procedimento descrito iria cumprir as condições para um método de ajuste para a rotina dos laboratórios de saúde pública e ambiental: reprodutível, confiável, simples e rentável. O protocolo é simples, no entanto ele deve ser seguido com atenção. Baixa condutividade nas amostras sem adicionar a concentração de sais solicitado artificial de água do mar reduziria drasticamente a recuperação de vírus como seria o caso se o tempo de agitação de floculação é significativamente reduzido (menos d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Governo espanhol "Ministerio de Educación y Ciencia" (projeto AGL2008-05275-C01/ALI), pela União Europeia Quadro de Investigação sete projectos financiados VIROBATHE (Contrato n º 513648), VIROCLIME (Contrato n º 243923 ) e pela Agência Catalã da Água, a Agência Catalã de l'Aigua (ACA), Departamento de Controle i Millora dels Ecosistemes Aquático. Durante o estudo desenvolvido Marta Rusiñol era um companheiro do Governo catalão "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
Riferimenti
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