Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux
Summary
L'étude décrit une méthode rentable pour l'identification de la source de contamination fécale / urinaire ou de la contamination par les nitrates dans l'eau en utilisant qPCR pour la quantification spécifique du virus de l'ADN humain / porcin / bovin, les adénovirus et les polyomavirus, a proposé que les outils MST.
Abstract
La contamination microbienne de l'environnement représente un risque significatif pour la santé. Classique bactérienne indicateurs fécaux ont montré pour avoir des limites importantes, les virus sont plus résistants aux procédés d'inactivation de nombreux standards et indicateurs fécaux n'informent pas sur la source de contamination. Le développement de méthodes rentables pour la concentration de virus dans l'eau et des dosages moléculaires facilite l'applicabilité de virus comme indicateurs de contamination fécale et en tant que sources de pollution microbienne de suivi (MST) des outils. Les adénovirus sont des virus et des polyomavirus ADN infectant les espèces de vertébrés spécifiques, y compris les humains et sont excrétés dans les selles persistante et / ou d'urine dans toutes les zones géographiques étudiées. Dans des études précédentes, nous avons suggéré la quantification des adénovirus humains (HAdV) et polyomavirus JC (JCPyV) par PCR quantitative (qPCR) comme un indice de contamination fécale humaine. Récemment, nous avons développé des tests qPCR pour la quantification spécifique du poradénovirus ciné (PADV) et polyomavirus bovin (BPYV) comme marqueurs fécaux des animaux de la contamination avec des sensibilités de 10 à 10 copies de génome par tube d'essai. Dans cette étude, nous présentons la procédure à suivre pour identifier la source de contamination dans les échantillons d'eau à l'aide de ces outils. Comme exemple de résultats représentatifs, l'analyse des virus dans les eaux souterraines présentant des niveaux élevés de nitrates est affiché.
Détection des virus à faible ou modérée des eaux polluées requiert de la concentration du virus dans au moins plusieurs litres d'eau dans un volume beaucoup plus petit, une procédure qui comporte généralement deux étapes de concentration en série. Cette procédure un peu lourde et la variabilité observée dans les recouvrements virale entravent de manière significative le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons d'eau.
Afin d'éliminer le goulot d'étranglement causés par les procédures en deux étapes, nous avons appliqué un protocole en une seule étape développé dans Studie précédentes et applicables à une diversité de matrices d'eau. La procédure comprend: l'acidification des échantillons d'eau de dix litres, floculation par du lait écrémé, de la sédimentation par gravité des matériaux floculées, la collecte du précipité et la centrifugation, resuspension du précipité dans un tampon phosphate 10 ml. Le concentré viral est utilisé pour l'extraction d'acides nucléiques viraux et les adénovirus et les polyomavirus spécifiques d'intérêt sont quantifiés par qPCR. Nombre élevé d'échantillons peuvent être analysés simultanément en utilisant cette méthode de concentration à faible coût.
La procédure a été appliquée à l'analyse des eaux de baignade, l'eau de mer et d'eau de la rivière et dans cette étude, nous présentons l'analyse des résultats des échantillons d'eau souterraine. Cette méthode quantitative à haut débit est fiable, simple et rentable.
Protocol
Discussion
La procédure décrite remplirait les conditions pour une méthode d'ajustement de routine des laboratoires de santé publique et d'environnement: reproductible, fiable, simple et rentable. Le protocole est simple, mais elle doit être suivie attentivement. Faible conductivité dans les échantillons sans ajout de la concentration de sels demandé l'eau de mer artificielle réduirait considérablement la récupération des virus comme ce serait le cas si le temps d'agitation pour la floculation est…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement financé par le gouvernement espagnol "Ministerio de Educación y Ciencia" (projet AGL2008-05275-C01/ALI), par la Commission européenne cadre sur l'union de recherche 7 projets financés VIROBATHE (contrat n ° 513648), VIROCLIME (contrat n ° 243923 ) et par l'Agence Catalane de l'Eau, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de contrôle i dels Millora Ecosistemes Aquatics. Au cours de l'étude ont développé Marta Rusiñol était un membre de la Generalitat "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
Riferimenti
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