Visualisatie van de interstitiële cellen van Cajal (ICC) Netwerk in Muizen

1. Dissectie van de muis maagdarmkanaal Gedood muizen door de lokale IUCAC richtlijnen Pin elke ledemaat op piepschuim oppervlak en spoel buik oppervlak met 70% ethanol. Open buikholte met lange middellijn incisie vanuit het middenrif tot schaambeen. Maak een snede in de distale slokdarm en een tweede snede bij de distale dikke darm en verwijder het spijsverteringskanaal van maag tot anus en bloc, zorgvuldig snijden ligamenten aan de twaalfvingerige darm en blindedarm met behulp van een klein schaartje. Plaats spijsverteringskanaal in een petrischaaltje met PBS. Ontleden weg mesenterium met een pincet (Figuur 1). De maag, dunne darm en dikke darm, knippen bij pylorus en Bauhin knooppunt te scheiden. Spoel het lumen van elk deel van het maagdarmkanaal met PBS met behulp van een 5ml spuit bevestigd aan een voeding naald (oudere muizen) of stompe naald (jongere muizen). Open maag, dunne darm en dikke darm langs de mesenteriale grens. Knip twee stukken voor elk deel van het maagdarmkanaal, een voor de ganse berg visualisatie en een voor cryosection. 2. Hele monteren monstervoorbereiding en immunokleuring Plaats het hele stuk van elk deel van maag-darmkanaal in een 1,5 cm microfugebuisje gevuld met 1,0 ml ijskoude aceton en vast monsters voor ten minste 1 uur bij 4 ° C. Monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 1 week bij -20 ° C. We meestal slaan monsters in aceton en ga verder met cyrosections voor te bereiden. Was monster 2X met PBS. Plaats monster in petrischaal met PBS. Onder ontleden microscoop, voorzichtig afschrapen mucosale laag met een scalpel door de holding een uiteinde met een pincet, het verlaten van de muscularis. Spier kan worden gesneden in 5mm stuks voor kleuring met verschillende antilichamen. Niet opslaan voor meer dan 2 dagen in PBS voor de kleuring. Blok en incubatie stappen kunnen worden gedaan in een putje van een 24-well plaat of in een 1,5 ml microfugebuis. Blok met 0,5 ml van het blokkeren van buffer (5% geit serum, 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij 4 ° C). Incubeer met primaire antilichaam verdund in de blokkeerbuffer en draait overnacht bij 4 ° C. We hebben met succes gebruikt ACK-2 rat anti-Kit, konijn anti-Ano1, en konijn anti-Pgp9.5 antilichamen voor ganse berg immunokleuring. Was gedurende 5 min. 2x met PBS op rotator bij kamertemperatuur. Incubeer met secundaire antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op rotator. Wij gebruiken meestal de Alexa Fluor 488 anti-konijn en Alexa Fluor 594 anti-rat antilichamen. Was gedurende 15 min 3X met PBS op rotator bij kamertemperatuur. Mount op dia, sereuze kant op de top om de oriëntatie van de weefsels te garanderen tijdens microscopie. Deze oriëntatie zal zorgen voor de sereuze kant naar de dekglaasje gezicht en eerst worden aangetroffen als een zich richt op de dia op een microscoop. We doen dit op een dissectie microscoop. Soms hebben we kort ingegaan op het weefsel onder fluorescentie microscopie goed te oriënteren. Onder fluorescentie microscopie aan Kit of Ano1 visualiseren, moet een eerste ontmoeting van de ICC-MY netwerk van de kant van de dekglaasje aan. Vervolgens aspiratie PBS zoveel mogelijk zonder dat het volledig drogen. Voeg 50 ul van harde set monteren media (we gebruiken Verleng Gold) en voorzichtig plaats dekglas op de top van het weefsel. Laat instelling van de montage 's nachts bij kamertemperatuur en op te slaan dia's bij -80 ° C. Voor microscopisch onderzoek hebben we gebruik gemaakt van een wide-veld microscoop met een Z-drive. We gebruikten ofwel een 20X lucht doelstelling (NA 0,75, plan apochromat) of 60X olie doelstelling (NA 1,4, plan apochromat) en nam 2 urn of een urn Z-profielen, dat beslaat het hele muscularis. De beelden werden vervolgens met behulp van deconvoluted Autoquant deconvolutie software. Als alternatief zijn er vele anderen gebruikt confocale microscopie in plaats daarvan met vergelijkbare resultaten. 3. Cryosection voorbereiding en immunokleuring Plaats elk deel van het maagdarmkanaal, de sereuze naar beneden, plat op filtreerpapier. Cut filter papier om het weefsel. Plaats tissue op filtreerpapier in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS (we 32% paraformaldehyde verdunnen in verzegelde flacon op in PBS vlak voor gebruik) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Fixatie kan worden gedaan in een 6 – of 12-well plaat afhankelijk van de grootte van het weefsel, of in een 1,5 ml microfugebuis. Indien het wordt gedaan in de plaat, tot een minimum te beperken parafilm PFA blootstelling. Langere fixatie tijden kan dit leiden tot antigeen maskeren, met name voor de ACK-2 anti-Kit antilichaam. Verwijderen weefsel van PFA en plaats in 30% sucrose in PBS. Laat weefsel een nacht zinken in 4 ° C. Evenwicht weefsel met 1:1 verhouding van 30% sucrose en de LGO gedurende 1 uur. Dient vervolgens verticaal te monteren weefsel in cryomold gevuld met oktober De lengteas van het maagdarmkanaal moet worden parallel met de cyrosections. Bij de behandeling van muizen met verschillende genotypes of met verschillende behandelingen, kan het nuttig zijn om weefsel monteren van verschillende muizen op dezelfde cryomold om parallelle verwerking te waarborgen. Freeze op droog ijs en plaats in de -80 ° C vriezer voor de opslag. Snij 10 urn vriescoupesop glijbaan en bewaar bij -80 ° C vriezer. We meestal gesneden uit twee delen per slide. We hebben ook meestal uit te voeren H & E kleuring van een cryosection dia. Voor immunofluorescentie, eerst evenwicht glijbaan bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Teken cirkel rond weefsel met behulp van PAP pen. Blok met 150 ul van het blokkeren van buffer (dezelfde als voor de gehele montage immunokleuring) gedurende 1 uur. Aspireren blokkeerbuffer en voeg 150 ul primair antilichaam verdund in de blokkeerbuffer en incubeer overnacht bij 4 ° C in een bevochtigde kamer. Was 5 min 2x met PBS. Incubeer met secundaire antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Wij gebruiken meestal de Alexa 488 anti-konijn en Alexa 594 anti-rat antilichamen. Was gedurende 15 minuten 3x met PBS. Aspireren glijden zonder dat het volledig drogen weefsel. Voeg een druppel harde set montage media met DAPI (we gebruiken Verleng Gold) en plaats # 1.5 dekglaasje aan. Plaats glijbaan bij kamertemperatuur gedurende de nacht in te stellen en op te slaan in de -80 ° C vriezer. Acquire triple fluorescentie beelden met behulp van DAPI, FITC, en Texas Red filter sets. 4. Representatieve resultaten: Hier gebruiken we de dikke darm als een voorbeeld. H & E kleuring van een sucrose beschermde vaste vriescoupe gebruikt voor immunofluorescentie toont enkele artefacten in vergelijking met een referentie-paraffine gedeelte (figuur 2), waar de gele lijn markeert de myenterische plexus tussen de circulaire en longitudinale spieren lagen en de groene lijn markeert de grens tussen de mucosa en muscularlis. Het onderzoeken van de cryosection, van de serosa tot mucosa, moet je eerst kennis met de dunnere longitudinale spier (LM) laag, gevolgd door de dikkere ronde spier (CM) laag. De sectie moet in parallel met de longitudinale spieren, zodat de kernen van LM moet enigszins worden verlengd, terwijl de kernen van de CM moeten klein en rond. Tussen de LM en CM zijn myenterische plexi gemaakt van neuronen die vlek met Pgp9.5. Pgp9.5 ook vlekken neuronale processen in de CM. De myenterische ICC-netwerk (ICC-MY) omringen de myenterische plexus en zijn gemaakt van multipolaire cellen. Binnen de longitudinale spierlaag, zijn er zeldzame intramusculaire ICC (ICC-IMS) die bipolaire cellen lopen parallel met de spier. Binnen de cirkelvormige spierlaag, zijn er in overvloed ICC-IMS, die ook bipolaire cellen die parallel lopen met de ronde spier en zijn cross-delig met deze verlaging. Op de kruising van de muscularis en submucosa, de submucosale ICC netwerk van ICC-SMP is een vlakke netwerk van multipolaire ICC. Het onderzoeken van de hele berg Kit immunokleuring van de dikke darm, moet men verwachten dat de ICC-MY-netwerk eerste ontmoeting, en vervolgens de ICC-IM van de CM, en de ICC-SMP-netwerken, als een zich vanaf het dekglaasje (Figure. 3) . Volumetrische meten van ICC-netwerken met behulp van 3D-reconstructie van de hele berg foto's zijn beschreven 10. Het gebruik van wide-field microscoop, er aanzienlijke out-of-plane fluorescentie in de ruwe beelden die kunnen worden verwijderd na deconvolutie (figuur 3). Onvolledige strippen van de mucosa zal resulteren in hoge achtergrond fluorescentie. ANO1 is een andere marker van ICC en co-immunokleuring van KIT en ANO1 toont volledige overlap van ICC kleuring (figuur 4). Figuur 1. Vertegenwoordiger ontleed muis maag-darmkanaal, met toestemming overgenomen 13. Figuur 2. A) Representatieve H & E kleuring van de muis dikke darm van vriescoupes bereid zoals beschreven en referentie in paraffine ingebedde sectie laten zien krimpen artefacten van vriescoupes. De gele lijn markeert de myenterische plexus en de blauwe lijn scheidt het slijmvlies van de muscularis. B) Representatieve Kit (rood, ACK-2) en Pgp9.5 (groen) dubbele immunofluorescentie met DAPI (blauw) tegenkleuring van de muis dikke darm. LM: longitudinale spieren CM: kringspier. Schaalbalk 20 urn. Figuur 3. Vertegenwoordiger Kit (rood, ACK-2) hele-mount immunofluorescentie van hetzelfde veld op drie centrale vliegtuigen, het ICC-mijn vliegtuig bij de LM / CM grens, het ICC-IM vliegtuig in de CM, en het ICC- SMP vliegtuig op de CM / submucosa grens. RAW-beelden en deconvoluted beelden worden getoond. Schaalbalk 20 urn. Figuur 4. Representatieve dubbele immunofluorescentie van Ano1 (groen) en Kit (rood, ACK-2) in de dikke darm. Schaalbalk 20 urn.