تصور من خلايا خلالية لشبكة (ICC) في الفئران كاجال
Summary
الخلايا من خلالي كاجال (ICC) هي خلايا تنظيم ضربات القلب من الجهاز (GI) الهضمي. انهم يشكلون شبكات معقدة بين خلايا العضلات الملساء وبعد العقدية الألياف العصبية لتنظيم انقباض الجهاز الهضمي. هنا ، نقدم أساليب المناعي مستعرضة وكله يشن التصور شبكات المحكمة الجنائية الدولية الفئران.
Abstract
الخلايا من خلالي كاجال (ICC) هي مشتقة الوسيطة "خلايا تنظيم ضربات القلب" من الجهاز (GI) التي تولد موجات الهضمي بطيء العفوية المطلوبة لالتمعج والتوسط من المدخلات العصبية system1 العصبي المعوي. فرعية مختلفة من المحكمة الجنائية الدولية شكل شبكات متميزة في العضلية والجهاز الهضمي 2،3. ويرتبط فقدان أو ضرر وقع على هذه الشبكات مع عدد من اضطرابات حركية 4. المحكمة الجنائية الدولية تعبر عن الخلايا مستقبلات كيناز التيروزين KIT على غشاء البلازما وكيت وقد استخدمت immunostaining على مدى السنوات ال 15 الماضية لتسمية شبكة 5،6 المحكمة الجنائية الدولية. الأهم من ذلك ، مطلوب النشاط العادي للمحكمة الجنائية الدولية من أجل التنمية KIT 5،6. رمي تحول الخلايا نتائج المحكمة الجنائية الدولية في الورم انسجة الجهاز الهضمي (GIST) ، التي تؤوي كثيرا الطفرات KIT اكتساب وظيفة من بين 7،8. نحن أظهرت مؤخرا أن ETV1 عامل بقاء النسب المحددة التي أعرب عنها في النسب للمحكمة الجنائية الدولية / GIST والمنظم الرئيسي الترانسكربتي المطلوبة لكل من الطبيعي تشكيل شبكة من المحكمة الجنائية الدولية وتكون الأورام GIST 9. نظهر أيضا أنها تتعاون مع تفعيل الطفرات في KIT تكون الأورام. هنا ، نحن تصف أساليب التصور شبكات المحكمة الجنائية الدولية في الفئران ، ويعتمد بشكل كبير على البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 10،11. في الآونة الأخيرة ، تم أيضا القناة كلوريد anoctamin 1 (ANO1) التي توصف بأنها علامة غشاء محددة من المحكمة الجنائية الدولية 11،12. لما لها من البلازما توطين الغشاء ، يمكن استخدام كل من البروتينات المناعي لتصور شبكات المحكمة الجنائية الدولية. هنا ، نحن تصف تصور من قبل المحكمة الجنائية الدولية الشبكات الثابتة والمجمدة cyrosections الاستعدادات لشن كله.
Protocol
Discussion
وتميزت في البداية الخلايا الخلالي من كاجال بواسطة y سانتياغو كاجال Ramóón احد بالضبط منذ القرن باستخدام كرومات الميثيلين البقع الزرقاء والفضية والعضلية المعوية. كاجال كان يعتقد في البداية كانت المحكمة الجنائية الدولية استنادا إلى عمليات الخلايا العصبية التي هي تذكرنا المحاور والتشعبات. على مدى العديد من السنوات التي تلت ذلك ، كان محدودا دراسة البيولوجيا المحكمة الجنائية الدولية بسبب الافتقار إلى علامات معينة حتى اكتشاف أن KIT ليس فقط هو المعبر عنها في المحكمة الجنائية الدولية ، ولكن مطلوب أيضا من أجل تنميتها 6. منذ ذلك الحين ، كيت المناعي تستخدم على نطاق واسع في دراسة علم الأحياء للمحكمة الجنائية الدولية ، وأدى أيضا إلى تقدير المحكمة الجنائية الدولية في أجهزة أخرى مثل تقلص المثانة البولية. مؤخرا ، تم التعرف ANO1 كمؤشر موثوق بها المحكمة الجنائية الدولية الثانية.
كانت هناك العديد من المنشورات على مدى السنوات ال 15 الماضية المناعي باستخدام المحكمة الجنائية الدولية لتحديد التثبيت باستخدام تقنيات مختلفة ومتزايدة. يعمل أفضل مقارنة بين أيدينا "ثابتة المجمدة" cryosections التي تم مسبوقة مع بارافورمالدهيد والسكروز المحمية لالأسيتون أو بارافورمالدهيد بعد التثبيت بعد cryosectioning. ليتصاعد كله ، وجدنا أن التثبيت الأسيتون تليها تشريح المخاطية يعطي نتائج أكثر قوة.
تاريخيا ، كان ACK – 2 على الضد من أدوات الاختيار للماوس للمحكمة الجنائية الدولية تحديد الهوية. وهو فأر وحيدة النسيلة التي تعترف المجال خارج الخلية ، وإنما هو أيضا الأجسام المضادة التي تسبب عرقلة علوص عندما تعطى للعيش الفئران. ومع ذلك ، هو تدمير ببطء حاتمة ACK – 2 قبل تثبيت بارافورمالدهيد وليس انقاذ القياسية أساليب استرجاع مستضد. لقد وجدنا أن حاتمة ACK – 4 وأكثر مقاومة للبارافورمالدهيد التثبيت. بالمقارنة مع الكتل المجمدة الثابتة والمقاطع ، وكتل البارافين وجزءا لا يتجزأ من أفضل المقاطع يحفظ التشكل وأكثر استعدادا للأرشفة على المدى الطويل (الشكل 4). وقد لا ACK – 2 أو 4 – ACK استخدمت بنجاح في أقسام البارافين. اتسمت أننا D13A2 ، وهو جسم الأرنب جديدة وحيدة النسيلة ، ويعمل جيدا بصورة استثنائية في كل من الأبواب الثابتة والمجمدة البارافين من الجهاز الهضمي.
وأعرب عن عدة في العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، بما فيها الخلايا الصباغية ، والخلايا المكونة للدم ، والخلايا الجرثومية ، وخاصة في الخلايا البدينة والتي توجد أيضا في الجهاز الهضمي. لحسن الحظ ، وجدت معظم الخلايا البدينة والغشاء المخاطي وليس في العضلية. يمكن تلوين مزدوجة مع الأرنب Ano1 المضادة للطائرات ومضادة للمجموعة الفئران القضاء غير محددة تلطيخ كل الأضداد (الشكل 4). ومن الجدير بالذكر أيضا أن التعبير النسبية لكيت وAno1 بين الفئات الفرعية للمحكمة الجنائية الدولية يبدو مختلفا. على سبيل المثال ، في الأمعاء الدقيقة ، وتلطيخ كيت هو أكثر من ذلك بكثير مكثفة في المحكمة الجنائية الدولية العضلية المعوية بالمقارنة مع المحكمة الجنائية الدولية من الضفيرة العضلية العميقة في حين Ano1 تلطيخ مشابه.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (K08CA140946 ، لYC) ، (5F32CA130372 ، لPC) ، (وR01CA102774 R01HL055748 لPB) ، وزارة الدفاع (PC094302 لYC) ، وصندوق عائلة شومان للبحوث GIST (ل PC) ، واتحاد السرطان ستار (لأجهزة الكمبيوتر ، البطاقة الصفراء ، وCLS PB). نود أن نشكر كاتيا MANOVA ، فان نينغ ، وMesurh تركيكول من MSKCC الجزيئية علم الخلية الأساسية للحصول على مساعدة مرفق مع cryosectioning وimmunostaining.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | Becton Dickison | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | EM Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
Riferimenti
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
