Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği
Summary
Bu makalede, bir açıklar<em> In vitro</emEndotel hücrelerinin bir tek tabaka ile istila izleme kanser hücreleri> tekniği. Bu veriler de alt elektrotların yüzeyini empedansın değişikliklerin bir fonksiyonu olarak gerçek zamanlı olarak elde edilir.
Abstract
Malign hücrelerin metastatik yayılması konakçıda, uzak bölgelere bir taşıma aracı olarak kan dolaşımına endotel tabakasının temel membran, vasküler endotelyum, tümör hücrelerinin bağlanma, endotel birleşme geri çekilmesi ve tümör hücre istilası ve son olarak göç bozunma gerektiren 1-3. Bir kez dolaşım sisteminde, kanser hücrelerinin duvarları kapiller ve metastatik tümörler 4,5 oluşturmak için çevre dokuya extravasate uygun. Tümör hücre-endotelyal hücre etkileşiminin çeşitli bileşenleri, kanser hücreleri, insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) tek tabakalı bir zorlu tarafından in vitro olarak çoğaltılabilir. Elektron ve faz-kontrast mikroskobu ile yapılan çalışmalar in vitro etkinlikleri sırayla oldukça in vivo metastaz 6'da temsil etmektedir. Burada, izler ve gerçek zamanlı invas içinde rakamlarla bir elektrik-empedans tabanlı teknik açıklarhabis tümör hücrelerinin endotel hücrelerinin iyon.
Giaever ve Keese ilk hücre popülasyonunun elektrotlar 7,8 yüzeyi üzerinde büyümeye zaman empedans dalgalanmalar ölçmek için bir yöntem tanımlanmıştır. Roche tarafından üretilen XCELLigence enstrüman,, hücrelerin iyi altındaki alanın yaklaşık% 80 kapsayan bir altın mikroelektrot dizi ile kaplı bir kültür çanak eklemek ve yaymak gibi elektrikli empedans değişiklikleri ölçmek için benzer bir teknik kullanır. Hücreleri eklemek ve elektrot yüzeyine yayılmış olarak, 9-12 elektrik empedans bir artışa yol açar. Empedans hücreleri ile kaplıdır de doku kültürü toplam alanı ile doğrudan orantılı olan bir boyutsuz olarak adlandırılan hücre-göstergesi olarak gösterilir. Bu nedenle, hücre dizini, hücre yapışması, yayma, morfolojisi ve hücre yoğunluğunu izlemek için de kullanılabilir.
Bu makalede açıklanan işgali tahlil değişikliği esas alınmaktadırelektrot / hücre interfaz de elektrik empedans, malign hücrelerin bir nüfus olarak bir HUVEC tek tabaka (Şekil 1) ile işgal. Endotel kavşak bozulması, tümör hücreleri tarafından endotel tek tabaka ve yedek geri çekilmesi empedans büyük değişikliklere yol. Bu değişiklikler doğrudan tümör hücrelerinin invaziv kapasitesi ile ilişkili, yani, son derece agresif hücreleri tarafından işgali hücre empedansı ve tersi büyük değişikliklere yol. Endotel hücre-tümör hücresi etkileşim daha yakından taklit eden in vivo sürecinde, ve 2), veri gerçek elde edilir: 1) Bu teknik, Boyden odasının ve Matrigel tahlilleri gibi istila ölçme mevcut yöntemleri, üzerinde bir iki kat avantaj sağlar zaman ve diğer yöntemler için son nokta analizi aksine, daha kolay ölçülebilir.
Protocol
Discussion
Gerçek zamanlı HUVEC işgali tahlil izleme işgali için basit ama güçlü bir yöntemdir. Bu son nokta analizi kullanan diğer geleneksel teknikleri üzerinde önemli bir avantaj olan, gerçek zamanlı sonuçlar sağlar. Tahlilinde test ilaçlarının, antikorlar, ligandlar ve metastazının önleyicileri veya uyarıcıları gibi proteinler için modifiye edilebilir. Kanser / endotel hücre çapraz konuşma farklı ajanların etkisi de değerlendirilebilir. Bu kültür ortamı içinde büyüme faktörleri ve uyuşturucu gibi eksojen ajanlar, tanıtan, bu onlar HUVEC tek tabaka bütünlüğünü etkilemez sağlamak için önemlidir. HUVEC tek tabaka bozulması hücreleri istila yokluğunda eksojen ajan tanıtan ve hücre indeksi bir değişiklik yoktur sağlayarak test edilebilir. Bu nedenle, uygun kontrollerin deney tasarımının bir parçası olarak dahil edilmelidir.
Bir conf biçimi olarak farklı hücre hatları farklı hücre-indeksi eğrileri göstermekluent tek tabaka. Eğri, hem de yüksek hücre-indeksi elde, şekli, hücre tipine bağlıdır. HUVEC hücreleri 16-18 saat sonra daha yüksek bir hücre dizindeki başka bir istikrar ardından, 4-6 saat tohumlama sonra hücre indeksi düzleştirme bir karakteristik geçici göstermektedir. Bu nedenle, bu hücrelerin, tümör hücrelerinin ilave edilmeden önce en az 18 saat boyunca konfluent tek tabaka oluşturacak izin vermek önemlidir.
Hücre indeksi elektrot / hücre interfaz iyonik ortamına bağlıdır, bu tür hücre morfolojisi ve hücre-hücre adezyon kalitesi gibi çeşitli faktörlere de kapalı alt alanında ek olarak, hücre dizini etkiler. Bu nedenle, tümör hücre istilasını üzerine oluşur hücre indeksi azalma, endotel birleşme ve takip eden tümör hücre istilası geri çekme dahil çeşitli faktörlere, bir fonksiyonudur.
XCELLigence araç üç farklı konfigürasyonlarda imal edilir: gerçek zamanlı hücre analiz(RTCA) SP, RTCA MP ve RTCA DP. RTCA MP alet 96-E-plakaları aynı anda altı tutabilir ise RTCA SP araçlar, bir 96-E-plaka tutar. Bu ilaçlar ve bileşiklerin yüksek verimli tarama için izin verir. Bu makaledeki deneyler üç 16-iyi E-plakaları tutabilir RTCA DP cihazı kullanılarak yapılmaktadır. Her E-plaka tutma istasyonu bağımsız olarak birden fazla kullanıcı aynı anda deneyler çalıştırmanıza olanak veren, çalıştırılabilir. RTCA DP araç aynı zamanda CIM-plakaları kullanarak göç incelemek için kullanılabilir. Bu 8um bir ortalama gözenek boyutu olan bir polietilen tereftalat (PET) membran ile ayrılan üst ve alt odaları ile 16 oyuklu plakalar vardır. Elektronik sensörler, üst bölmenin gözenekli zarın alt kısmında bulunur. Alt bölme odasının üst hücreleri için kemo-çekici için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Bununla birlikte, CIM-plakalar üzerinde HUVEC işgali tahlil önemli bir avantajı ise, bu eski içinde tümör hücre istilasını iendotel hücre işgali tümör ve endotel hücreleri arasında çapraz konuşma bağlıdır gibi s, gözenek boyutu ile sınırlı değildir.
HUVEC işgali tahlil da Uygulamalı Biyofizik (Troy, New York) tarafından üretilen, ECIS Z enstrüman üzerinde gerçekleştirilebilir. ECIS Z enstrüman dizi ve elektrot konfigürasyonları farklılıklar ile, XCELLigence araç benzer bir teknoloji kullanır. Biz başarıyla 8-iyi ECIS dizileri kullanarak HUVEC işgali deneyleri gerçekleştirdik. 2.5 x 10 5 ve 1 x 10 5 hücre sırası: Bu iyi alt yüzey alanı kaplama için endotelyal ve tümör hücrelerinin daha büyük bir sayı gerektirir ECIS dizileri, daha büyük olduğuna dikkat etmek önemlidir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma cömertçe Çocuk Kanseri Vakfı (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Vakfı (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) ve NIH (R01CA108641) fon tarafından desteklenmiştir.
Biz Dr Anton Wellstein ve deneyim paylaşımı ve sunulan yöntemleri optimize etmek için bize yardımcı olduğunuz için onun laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |
Riferimenti
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
