Une technique non invasive cheveux d'échantillonnage pour obtenir l'ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

1. Snare cheveux Avant de mettre en place un piège, un emplacement idéal doit être déterminée dans l'habitat ou des talus d'éboulis pika. Cela inclut des tas de foin, qui sont des caches végétation qui recueillent les animaux en fin d'été ainsi que des excréments frais trouvés sur les sites des latrines. Des bandes de ruban adhésif d'emballage (10-50cm de longueur) sont enroulées pour fournir une surface de 360 ​​° collants et sont disposées de façon toile d'araignée à l'enveloppe de l'entrée de tas de foin le pika (fig. 1) ou le site des latrines. Selon la configuration de la roche, un morceau de fil de pêche peuvent être utilisés pour soutenir la structure de la caisse claire de cheveux, mais ce n'est souvent pas nécessaire lorsque les entrées sont assez petites (<30 cm de diamètre), une description complète de l'utilisation de la ligne de pêche peuvent être trouvés dans Henry et Russello (2010) 3. Cheveux pièges sont vérifiés aussi souvent que possible, et des échantillons de cheveux déposé sur la bande (Fig. 2) sont ensuite recueillies et étiquetées. Une fois transporté au laboratoire, les poils sont retirés de la bande collante en utilisant une pince stérile et transféré dans des tubes cryogéniques et conservés à -20 ° C jusqu'à ce que davantage de manipulation. Les échantillons de cheveux regroupés le long d'un filet de cheveux sont considérés comme appartenant à un seul individu, tandis que les échantillons groupés de façon indépendante sont supposés appartenir à des individus différents. Dans ce dernier cas, les cheveux sont ensuite placés dans des tubes différents. Ces hypothèses peuvent ensuite être testées au moyen d'empreintes ADN et des calculs de probabilité d'identité basée sur des microsatellites données génotypiques. 2. Extraction de l'ADN Depuis les cheveux Pika est très mince et contient une ampoule minuscule racine, nous avons montré précédemment que d'un minimum de 25 poils sont nécessaires pour obtenir des quantités suffisantes d'ADN pour l'amplification par PCR de bonne qualité aval 3. Nous avons utilisé l'ADN du système IQ (Promega, Madison, WI, USA) et une version légèrement modifiée des instructions du fabricant pour l'isolement de l'ADN provenant d'échantillons de cheveux. Premièrement, l'échantillon de cheveux est centrifugé dans une centrifugeuse micro-afin d'éviter la perte des cheveux, tout en ouvrant le tube. Puis la solution d'incubation est préparé en mélangeant 80 pi de solution d'incubation avec 10 ul de la TNT (1M) et 10 pi de la protéinase K (18ng/ml) pour aboutir à une concentration finale de 0,1 M TNT et 1.8ng/ml de protéinase K. incubation solution (100 pi) est ajouté à l'échantillon et incubés à 56 ° C pendant 1 heure. En attendant, la solution de lyse est préparée en ajoutant 1 pl de la TNT (1M) pour chaque 100 ul de tampon de lyse, résultant en une concentration finale de 0,01 M de DTT. Préparé solution de lyse (200 pi) est ensuite ajouté à l'échantillon, avec 7 pl d'ADN QI de résine, vortexés pendant 3 secondes à grande vitesse et incubée à température ambiante pendant 5 minutes. L'échantillon est ensuite vortexé pendant 2 secondes et insérées dans le support magnétique, où la séparation des billes magnétiques de la solution de produit. La solution restante est ensuite aspiré et mis au rebut, en faisant attention à ne pas perturber le culot de résine magnétique. L'échantillon est ensuite traitée avec 100 pi de la solution de lyse préparé, vortex et remis sur le stand magnétique où la séparation se produit à nouveau. Le tampon de lyse est aspirée et mis au rebut, et cette étape est répétée trois fois en utilisant un tampon de lavage (100 pi). L'échantillon est ensuite mis à sécher dans le support magnétique pendant 15 minutes. Une fois sec, 100 pi de tampon d'élution est ajouté à l'échantillon et incubés à 65 ° C pendant 5 minutes. L'échantillon est vortexé et inséré dans le support magnétique. La solution contenant maintenant l'ADN élue est alors transféré dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et stockés à -20 ° C jusqu'à ce que de nouvelles manipulations. L'ADN d'échantillons de foie a également été extraites en utilisant le système IQ ADN et utilisé comme contrôle positif pour des amplifications PCR. 3. L'amplification par PCR L'ADN obtenu à partir de notre filet de cheveux non invasive et des échantillons de foie ont ensuite été utilisées pour amplifier un ensemble de communément utilisé des marqueurs moléculaires (microsatellites, AFLP, mitochondrial du cytochrome b et le marqueur de sexage ZFX / ZFY). PCR ont été effectuées en utilisant une Veriti thermocycleur (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dans un volume de 25 ul contenant: 10 – 20 ng d'ADN, 0,5 uM de chaque amorce, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP, 10 μ de sérum albumine bovine (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) et 0,5 U AmpliTaq ADN polymérase Gold (Applied Biosystems). Paramètres de cyclisme pour les loci microsatellites ont été optimisés en utilisant un programme de cyclisme touchdown (10 min à 95 ° C, 35 cycles à 95 ° C pendant 30 s, 30 s recuit, et 45 s à 72 ° C, suivie d'une étape finale à 72 ° C pendant 10 min.) La température de recuit a diminué de 1 ° C par cycle de 60 à 55 ° C jusqu'à atteindre le sixième cycle, à quel point les 29 cycles restants ont continué à 55 ° C. Cyclisme paramètres pour les fragments mitochondrial ont été décrits ci-dessus, mais se composait de 35 cycles, avec un recuittempérature de 50 ° C. Amplified fragment length polymorphism a été entrepris suivant le protocole pour les génomes de vertébrés décrites par Bonin 4. Enfin, le sexage moléculaire a été entreprise en utilisant la PCR-RFLP du ZFX / ZFY loci à la digestion des enzymes de restriction Hinfl 5. Les produits de PCR de la microsatellites, AFLP et le cytochrome séquences B ont été effectuées sur un analyseur ABI 3130XL génétique (Applied Biosystems), tandis que digérée ZFX / ZFX fragments ont été longent une échelle de 100 pb (New England Biolabs) sur un gel d'agarose 3% contenant 2,5% de gel de l'ADN SYBR Safe. tache (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et visualisés en utilisant un système Red personnels imagerie gel (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) Microsatellites et AFLP ont été visualisées en utilisant GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) et le chromatogramme ADN mitochondrial a été visualisée en utilisant Sequencher v4.7 (Gene Code des sociétés, Ann Harbour, MI, USA). 4. Les résultats représentatifs L'ADN extrait d'échantillons de poils obtenus en utilisant notre piège non invasif ont été utilisés pour amplifier par PCR différents types de marqueurs moléculaires. Comme base de comparaison, en utilisant l'ADN extrait des échantillons de foie a été amplifié aux côtés de nos échantillons de cheveux. Nucléaire loci microsatellites ont été amplifié avec succès à la fois pour les cheveux et échantillons de foie (Fig. 3). Bien que l'intensité du signal était plus grande lors de l'utilisation des échantillons de foie, cela n'a pas eu un effet négatif sur la notation génotype (Fig. 3). Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant les AFLP (fig. 4), les séquences d'ADN mitochondrial (fig. 5), et le marqueur ZFX / ZFY sexage moléculaire (Fig. 6). Figure 1. Un exemple d'un piège de cheveux non invasif mis en place à un tas de foin. Des bandes de ruban adhésif d'emballage enroulé claires sont disposées d'une façon toile d'araignée pour enfermer l'entrée de la pile de foin. Un morceau de fil de pêche est utilisé ici pour offrir un soutien supplémentaire pour la caisse claire cheveux. Figure 2. Un piège cheveux réussie contenant un grand nombre de cheveux collée au ruban d'emballage. Figure 3. Un chromatogramme représentant microsatellites nucléaires (Ocp6) 8 tel qu'il apparaît dans GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l'ADN des tissus du foie, et il est hétérozygote (354/358) à ce locus. Le chromatogramme du bas représente un autre individu présentant un génotype hétérozygote (358/362) basées sur l'ADN extrait de poils. Alors que le signal du chromatogramme de l'échantillon de cheveux a une intensité plus faible que l'échantillon du foie, marquant le génotype n'est pas affectée par cette différence de signal. Figure 4. Un chromatogramme AFLP représentant (E31T32) tel qu'il apparaît dans GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l'ADN des tissus du foie, le chromatogramme du bas représente l'ADN extrait de poils. Figure 5. Un représentant chromatogramme séquence d'ADN mitochondrial (cytochrome b) tel qu'il apparaît dans Sequencher v4.7 (Gene Code des sociétés). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l'ADN des tissus du foie, le chromatogramme du bas représente l'ADN extrait de poils. Figure 6. Un marqueur sexage représentant moléculaire (ZFX / ZFY) amplifié à la fois pour le foie et les échantillons de cheveux. Cette approche repose sur l'observation que le chromosome Y possède un site de restriction Hinfl dans cette région que le chromosome X manque. Ainsi, les femelles produisent deux co-migration des fragments de 432 pb alors que les mâles produisent des fragments de 432 pb, 261 pb et 171 pb.