見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

1。髪のスネアスネアを設定する前に、理想的な場所は、ナキウサギの生息地や崖錐斜面内で決定する必要があります。これは、植生、動物、夏の終わりに収集したキャッシュだけでなく、便所のサイトで見つけた新鮮scatsな干し草の山を、含まれています。パッキングテープ（長さが10 50CM）​​のストリップは360 °粘着性表面を提供するためにロールアップされており、エンベロープナキウサギの干し草の山（図1）やトイレのサイトへの入り口をへのWebのような方法で配置されています。岩の構成に応じて、釣り糸の一部は、（直径<30センチメートル）の使用の完全な説明を髪のスネアの構造をサポートするために使用されますが、入り口がかなり小さいとき、これは、ほとんどその必要はありませんすることができます釣り糸は、ヘンリーとRussello（2010）3で見つけることができます。髪のスネアが可能、と毛髪ほど頻繁にチェックされ、収集とラベル付けされています（図2）テープ上に堆積。研究室に戻ったような一度、毛は、滅菌ピンセットを用いて粘着テープから削除され、極低温のチューブに移し、さらに操作まで-20℃で保存されています。独立してクラスタ化されたサンプルは別の個人に属すると仮定している間毛のスネアに沿って一緒にクラスタ化された毛髪サンプルは、単一の個体に属すると考えられている。後者のケースでは、毛は、その後別のチューブに配置されます。これらの仮定は、後のマイクロサテライト遺伝子型のデータに基づいて、DNAの指紋とアイデンティティの確率の計算の方法によって試験することができる。 2。 DNAの抽出ナキウサギの毛は非常に薄いものと小さなルートの電球を含んでいるので、我々は以前に25毛の最小値が良い品質のダウンストリームのPCR増幅3用のDNAの十分な量を得るために必要とされることが示されている。我々はDNA IQシステム（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン、米国）と毛髪のサンプルからのDNA単離のための製造業者の指示を少し変更したバージョンを使用する。まず、毛のサンプルはチューブを開いている間に髪の損失を避けるために、マイクロ遠心機でスピンダウンしています。その後、インキュベーション溶液は、プロテイナーゼKのインキュベーションの0.1 M DTTと1.8ng/mlの最終濃度につながることDTTの10μlの（1M）およびプロテイナーゼK（18ng/ml）の10μlをしてインキュベーション溶液80μlを混合して調製され溶液（100μl）を試料に添加し、℃で1時間56でインキュベートする。その間に、溶解液は、0.01Mの最終DTTの濃度で、その結果、溶解バッファーのすべての100μlのためにDTT（1M）を1μl添加して調製される。準備された溶解液（200μl）をその後、DNA IQ樹脂の7μlのと一緒に、サンプルに加え、高い速度で3秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。次いで、試料を2秒間ボルテックスし、溶液から磁気ビーズの分離が発生する磁気スタンドに挿入されます。残りの溶液は、次いで、磁性樹脂のペレットを乱さないように注意しながら、吸引し、廃棄されます。サンプルは、その後、準備溶解液100μlで処理ボルテックスし、分離が再び発生する磁気スタンドに戻されます。溶解緩衝液を吸引し、廃棄され、このステップは、洗浄緩衝液（100μl）を使用して3回繰り返されるている。サンプルは、その後15分間マグネチックスタンドで乾燥するために残されている。一度乾燥、溶出バッファー100μlをサンプルに追加され、℃で5分間65℃でインキュベートした。サンプルをボルテックスし、マグネットスタンドに挿入されます。今溶出したDNAを含む溶液は、次いで、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに移し、さらなる操作まで-20℃で保存されます。肝臓サンプルからのDNAは、DNAのIQシステムを利用して抽出し、PCR増幅のためのポジティブコントロールとして使用した。 3。 PCRの増幅私たちの非侵襲的な髪のスネアと肝臓サンプルから得られたDNAを、一般的に使用される分子マーカー（マイクロサテライト、AFLP、ミトコンドリアのチトクロームBとZFX / ZFY性判別のマーカー）のスイートを増幅した。 PCRは含む25μLボリュームでVeritiサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った：10 – 20 ngのDNAを、各プライマー0.5μM、10mMトリス- HCl（pH8.3）を、50mMののKCl、1.5mMのMgCl 2、200μMのdNTPを、10μウシ血清アルブミン（BSA;ニューイングランドバイオラボ、イプスウィッチ、MA、米国）、0.5 UのAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ社）。マイクロサテライト遺伝子座のためのサイクリングパラメータはタッチダウンサイクルプログラムを（95時10分使用して最適化を行った° C、95℃30秒C、30秒のアニーリングでは35サイクル、そして72℃で45秒° C、72最後のステップに続いて℃で10分間）。アニーリング温度は29、残りのサイクルは55℃を続け、その時点で6サイクル目、℃に達するまで° Cサイクルあたり60から55に1ずつ° Cの減少ミトコンドリアの断片のためのサイクリングパラメータは上記のように説明するが、アニーリングを35サイクルで構成されていた50℃の温度増幅断片長多型は、小笠原4で説明した脊椎動物のゲノムのためのプロトコールに従って実施されました。最後に、分子性判別は、HinfIを制限酵素消化5でZFX / ZFY遺伝子座のPCR – RFLPを用いて行われた。消化ZFX / ZFX断片が含まれている3％アガロースゲル上で100 bpのラダー（New England Biolabs社）と一緒に実行している間マイクロサテライト、AFLPsとチトクロームBのシーケンスからのPCR産物は、ABI 3130XL遺伝子アナライザー（アプライドバイオシステム社）に実行されました2.5％のSYBR Safe DNAゲル染色（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）とRED個人的なゲルイメージングシステム（アルファイノテック、サンリアンドロ、カリフォルニア州、米国）を用いて可視化。マイクロサテライトとAFLPsはGenemapper V3.7を使用して可視化した（Applied Biosystems社）およびミトコンドリアDNAのクロマトグラムは、Sequencher v4.7（ジーンコード（株）、アンハーバー、ミシガン、米国）を用いて可視化した。 4。代表的な結果私たちの非侵襲的なスネアを用いて得られた毛髪サンプルから抽出したDNAは、分子マーカーの様々な種類をPCR増幅した。比較の基準として、DNAは肝臓のサンプルを使用して抽出私たちの毛髪サンプルと一緒に増幅した。核マイクロサテライト遺伝子座が正常に髪と肝臓試料（図3）の両方で増幅された。肝臓のサンプルを使用する際、信号の強度が大きいが、これは遺伝子型のスコアリング（図3）に悪影響を持っていませんでした。 AFLPs（図4）、ミトコンドリアDNA配列（図5）、およびZFX / ZFY分子性判別のマーカー（図6）を使用する場合にも、同様の結果が得られました。 図1非侵襲性の毛のスネアの例は、干し草の山に設置。明確なパッキングテープをロールアップさのストリップは、干し草の山への入り口を囲むようにウェブのような形式で配置されています。釣り糸の部分は毛のスネア用の追加サポートを提供するために使用されています。 図2。パッキングテープに付着した毛の多数を含む成功した毛髪スネア。 図3代表的な核マイクロサテライトのクロマトグラム（Ocp6）8としてGenemapper V3.7（Applied Biosystems社）で表示されます。上部クロマトグラムは、肝臓の組織からDNAを増幅することによって得、そしてこの遺伝子座で（358分の354）ヘテロ接合体であるれました。下のクロマトグラムは、髪の毛から抽出したDNAに基づいて、ヘテロ接合体遺伝子型（362分の358）を示す別の個々を表しています。髪のサンプルからのクロマトグラムのシグナルが肝臓のサンプルよりも低い強度を持っているが、遺伝子型スコアに悪影響を信号でこの違いによる影響を受けません。 図4のようなGenemapper V3.7（Applied Biosystems社）で表示される代表的なAFLPのクロマトグラム（E31T32）。上部クロマトグラムは、肝臓の組織からDNAを増幅することによって得られた、下のクロマトグラムは、髪の毛から抽出したDNAを表します。 図5。としてSequencher v4.7（遺伝子コード株式会社）に表示されている代表的なミトコンドリアDNA配列のクロマトグラム（チトクロームB）。上部クロマトグラムは、肝臓の組織からDNAを増幅することによって得られた、下のクロマトグラムは、髪の毛から抽出したDNAを表します。 図6。肝臓や毛髪サンプルの両方で増幅された代表的な分子性判別のマーカー（ZFX / ZFY）。このアプローチは、Y染色体はX染色体が欠けているこの地域でHinfI制限部位を有していることを観察に依存しています。男性は432 bpの、261 bpおよび171 bpの断片を生成しながらこのように、女性は432 bpの2人の共同の移行のフラグメントを生成する。