Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

1. Zebra balığı embriyoların DNA mikroenjeksiyon Rag2 Linearize: cMyc ve rag2: GFP 11 DNA yapıları 37 ° C gecede Noti her plazmid 10μg sindirerek. Fenol: kloroform ekstresi ve plazmid çökelek ve 20μL H 2 O. her tekrar süspansiyon DNA konsantrasyonu yüksek oranda DNA merdiveni 20μL, 10μL ve 5μL% 1 agaroz jel üzerinde her sindirilir plazmid 1:1, 1:5 ve 1:10 seyreltme çalıştıran belirleyin. Nicelikleme Bu tür genelde bir spektrometre okuma daha doğru. DNA CG1-gerinim (ya da diğer singeneik suşu) içine enjeksiyon için 1M KCl 0,5 X TE 60ng/μL bir final konsantrasyon sulandırınız zebrafish embriyoları kullanarak 30ng/μL rag2: cMyc + 30ng/μL rag2: GFP. Enjeksiyonlar önceden gösterilmiştir 12, 13 olarak yapılmalıdır. Kısacası, erkek ve kadın zebrafish çiftleşme odalarında bir gece önce enjeksiyon ayarlanır. Enjeksiyon gününde, DNA enjeksiyon iğnesi yüklenir, basınç 50μm çaplı bir kabarcık bir sahne mikrometre ile ölçülür, (30pg DNA) sınırdışı şekilde ayarlanır. Daha sonra, embriyolar DNA hücre içine yumurta sarısı içine enjekte ve tek hücreli aşamada enjekte edilir. Survival enjekte CG1 embriyoları ve larvaları, genellikle kötü ve sadece% 5 balık transgen başarıyla bir araya getirecek, bu yüzden> 600 embriyolar bazı balık lösemi gelişecektir sağlamak için enjekte edilmelidir. 28.5 ° C'de enjekte edilen embriyolar Mağaza ve 24 saat sonra ölü embriyolar kaldırmak. Hayvanlar daha sonra 5 gün yaşam büyük tanklara aktarılır ve daha önce 14 açıklandığı gibi kaldırdı. 2. Birincil T-ALL Zebra balığı larvaları için tarama Enjeksiyon sonrası yaklaşık 28 gün, bir petri balık sistem su 25ml 4NG / m Tricane-S 200μL ekleyerek larva zebrafish uyutmak. T-ALL 485/20 bir dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresans (Şekil 1) tespit etmek için filtre kullanarak, 20X büyütme Epifloresans bir mikroskop kullanılarak floresan-etiketli larva gelişimi için inceleyin. Negatif olanlar ayrı tümör pozitif larvaları. Negatif larvaları daha sonraki bir zaman noktasında muayene olabilir, bir kez tümörleri herhangi bir T-ALL olumlu balık cevapsız emin olmak için, daha büyük artış var olabilir. Monitör T-ALL Epifloresans mikroskop kullanılarak tümör büyümesini izlemek için her hafta en az bir kez olumlu bir balık. 3. İzolasyon ve saflaştırma floresan etiketli birincil lösemi hücrelerinin GFP pozitif lösemi hücrelerinin>% 50 hayvanın elinden almış, 9ml balık sistemi su içeren bir petri 4ng/mL Tricane-S 1ml ekleyerek balık kurban. Balık hücreleri tampon% 5 fetal sığır serumu ile 1mL 0.9X PBS içeren yeni bir petri kabına yerleştirin. Bir jilet, pipetlemeyin büyük hücre kümeleri ayırmak karışımı ile balık ıslatarak yumuşatmak, sonra 50ml tüp içine 40μm mesh süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. Bu tek hücre içine bütün doku kümeleri ayırmak gerekli değildir. 4ml polistiren tüp hücrelerinin pipetleyin 500μL. Ölü hücreleri etiket 1μL 1mg/ml propidium iyodür (PI), ekleyin. Vortex, daha sonra buz üzerinde hücreler tutun. , Vahşi bir CG1 balık türü Kurban ıslatarak yumuşatmak ve toplam 50ml tüp 0.9X PBS transplant.Add 4ml% 5 FBS sırasında, tümör hücreleri için bir taşıyıcı olarak hizmet normal hücreleri toplamak için, yukarıdaki gibi aynı şekilde zorlanma 5 ml'lik bir hacim. 96 plaka pipetlemeyin 100μL/well sonra, 0.9X PBS içinde% 5 FBS normal hücreleri, sulandırmak için 3×10 5 hücre / mL sayın. Aşağıdaki dozlarda kan hücreleri içeren 96 plaka bir Floresan Aktive Hücre Sıralayıcısı (FACS), tür, GFP pozitif, PI negatif tümör hücreleri (Şekil 2A, B): 10 hücre / 48 kuyu, 100 hücre / kuyu içine 24 kuyu, 1000 hücre içine / 12 kuyu, ve 10.000 hücre içine / 6 kuyu içine. Ayrıca, 10.000 hücreleri normal kan hücrelerinin olmadan bir kuyunun içine sıralanmış ve tekrar analiz sıralanmış hücreleri saflık ve canlılığını değerlendirmek için (Şekil 2C) FACS kullanarak olmalıdır. 4. Yetişkin zebrafish seyreltme nakli sınırlandırılması Pelet 2000xg 96-iyi bir plaka 10 dakika santrifüj edilerek hücreleri. Süpernatantı 95μL çıkarın ve kalan 5μL hücrelerin tekrar süspansiyon. Bir yetişkin (> 60 gün) singeneik zebrafish ventral tarafta tutun, ve 26g / 2 "mikro şırınga kullanarak, periton boşluğuna hücre süspansiyonu enjekte. Zebra balığı nakli öncesi anestezi olmak zorunda değilsiniz. Tipik olarak, 45 balık, 10 lösemi hücreleri ile nakledilen, 20 ile 100 hücre nakledilen, 7, 1000 hücreleri ve 5 balık ile nakledilen 10.000 T-ALL hücreleri nakledilen. 5. Lösemi başlatan hücre frekans belirlemek için analiz Nakli yaklaşık 28 gün sonra, bir 485/20 dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresan tespit için filtre kullanarak bir epifluoresence mikroskop ile nakledilen balık inceleyin. Enjekte edilen balıkların toplam sayısı başına olumlu bir balık numarasını kaydedin. Tekrar gözden geçirin 90 gün kadar her 14 günde bir balık ve pozitif balık sayısını kaydedin. Can çekişen bir tümör pozitif balık hale geldiğinde, Tricane-S aşırı doz hayvan kurban. Şekil 3 boyutlu olarak gösterildiği gibi bir tabloya sonuçları, Giriş. Web tabanlı ELDA (Extreme sınırlandırılması Seyreltme Analizi) istatistiksel yazılım veri yükleme http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html tümör pozitif ve negatif hayvanların frekansı kullanır 15, birincil T-ALL içinde kendini sürekli yenileyen lösemi hücrelerinin sıklığını belirlemek için her doz nakli. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Singeneik balık embriyolara DNA mikroenjeksiyon genellikle 24 saat boyunca hayatta kalan embriyoların <% 60 ile enjekte edilen embriyoların bir hayatta kalma oranı düşük sonuçları. Ayrıca, enjekte singeneik balık yaşam genellikle larva gelişimi sırasında, genellikle kötü <% 20, 28 gün boyunca hayatta. T-ALL gelişecektir transgenik balık oluşturmak için çok sayıda embriyo enjekte bu nedenle önemlidir. Bir örnek olarak, CG1 gerginlik embriyolar rag2 enjekte edildi: cMyc + rag2: GFP. Transgenlerin GFP ifade her hücre cMyc ifade, böylece gelişmekte olan embriyonun co-ayırınız. Larva T-ALL 28 gün sonra (Şekil 1), ilköğretim için tarandı. Önceki iş enjekte balık yaklaşık% 5 (Şekil 1), timus içinde T-hücrelerinin GFP pozitif olduğunu göstermiştir ve bu balıkların% 100, T-hücrelerinin dönüştürülmüş 11 olarak lösemi gelişecektir . Zebrafish küçük bir kısmı, 28. günde tespit etmek çok kolaydır, daha gelişmiş lösemi sahip olsa da, çoğu sadece bir GFP pozitif timus (Şekil 1) sahip olacak, böylece larva tüm olumlu sağlamak için yüksek büyütme altında tek tek incelenir olmalıdır balık seçilir. GFP pozitif T-ALL hücrelerinin>% 50 hayvanın gün 45-70 arasında geçeceği tahmin ediliyor. Zebrafish verilen örnekte 65 gün yaşam kurban edildi ve lösemi hücreleri izole edildi ve FACS seyreltme nakli sınırlandırmak için sıralanır. Tek hücre propidium iyodür negatif ve GFP pozitif (Şekil 2) 96-plaka halinde sıralanır. Reanalysis canlılığı (ideal% 95) ve saflık değerlendirmek için 10.000 sıralanmış hücreleri üzerinde yapıldı (ideal>% 92, Şekil 2). Nakledilen T-alls genellikle 28 gün önce ortaya çıkan, ancak bazı tümörler geliştirmek için 60 gün daha sürebilir. Bu örnekte bazı T-alls (Şekil 3C) periton boşluğu doldurmak için genişletilmiş olan, daha ilerledi iken, 28. günde, erken evre tümörler, enjeksiyon bölgesi (Şekil 3B) yakın GFP pozitif hücreler bir alan olarak görüldü . T-alls üç farklı ilköğretim seyreltme hücre nakli deneyleri sınırlayıcı elde edilen veriler Şekil 3 boyutlu olarak gösterilmiştir. Bu deneyler için, 220'den fazla hayvan, birkaç saat içinde tek bir kişi tarafından kolayca yapılabilir hangi, nakledilen. ELDA yazılımı kullanarak Veri analizi, ortalama 1 135 T-ALL hücreleri yayılan lösemi hücreleri (Şekil 3E), kendini sürekli yenileyen, o gösterdi. Şekil 1 Zebra balığı larvaları, bez ile tek hücreli aşamada enjekte:: cMyc + bez:-eGFP birincil lösemi büyüme için tarandı 28 gün sonrası enjeksiyon . Balık (*) T-hücrelerinin timus içinde GFP pozitif vardı; T-hücrelerinin zaman içinde dönüştürülmüş olarak bu balığın T-ALL gelişecektir. Bu aşama, 28 gün çok yaygın. Bir balık (**) gelişmiş bir T-ALL yumuşak doku içine yayıldı. Kalan iki balık tümör büyüme için olumsuz. 16x büyütme görüntü alındı. Şekil 2 floresan etiketli T-ALL hücreler hastalıklı hayvanların sıralanır ve sınırlayıcı seyreltme hücre nakli tayininde kullanıldı. Birincisi, bir kapı, tek hücreleri (sol üst panel) seçmek için çizilmiş oldu, sonra propidium iyodür negatif hücreler (orta sol panel) seçilir. Son olarak, bir kapı sadece GFP pozitif sıralama için lösemi hücrelerinin (sol alt panel) seçmek için çizilmiş oldu. Sıralama hücre nakli öncesi canlılığı ve saflık (sağ paneller) değerlendirmek için tekrar analiz edilmelidir. Şekil 3 Zebra balığı nakli 28 gün sonra lösemi büyüme yönünden incelendi. Fish ya tümör negatiffonlanır (A), (B) enjeksiyon yerinde büyüyen küçük bir tümör, ya da ilerlemiştir lösemi (C). 7X büyütme görüntüleri alınmıştır. Her seyreltme nakledilen balık toplam sayısı başına lösemi pozitif balık toplam sayısı (D) olarak kaydedilir. Veri sayısını hesaplamak için web tabanlı ELDA programına girdi, kendini sürekli yenileyen, lösemi hücrelerinin ve alt ve üst% 95 güven aralığı (E).