모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오
Summary
간단한 슬롯 얼룩 방법은 생물 정보학 분석을 통해 확인된 그들의 가장 보존 시퀀스를 대상으로 보편적인 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 부량 위해 개발되었습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 모든 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 양적 결정에 유용한 대안을 제공할 수 있습니다.
Abstract
적혈구응집소 (HA)과 neuraminidase (NA)는 바이러스 생활주기 및 보호 면역 반응의 1,2의 유도에 중요한 역할을한다고 알려져 있습니다 인플루엔자 바이러스의 두 표면 단백질입니다. 중화 항체의 주요 대상으로, HA는 현재 인플루엔자 백신 힘 마커로 사용되며 하나의 방사상 immunodiffusion (SRID) 3로 측정됩니다. 그러나, 해당 subtype 특정 antisera의 예약 상황에 SRID의 의존은 모든 새로운 백신의 출시를 2-3 개월 지연 최소됩니다. 또한, NA는 또한 보호 면역 4, 인플루엔자 백신의 NA의 양에 따라 적절한 시약이나 분석 방법 5 부족으로 아직 표준화되지를 유도 증거에도 불구하고. 따라서, HA와 NA 항원을 quantifying 수있는 간단한 대체 방법은 빠른 출시 및 인플루엔자 백신의 더 나은 품질 관리를 위해 바람직합니다.
사용 가능한 모든 인플루엔자 HA와 NA 시퀀스에서 보편적으로 보존 지역은 6-7 생물 정보학 분석에 의해 확인되었습니다. 이 보존 시퀀스가 neuraminidases 한 효소 활성화된 사이트를 가까이 (HCA – 2로 지정)와에서 확인된 동안 하나의 시퀀스 (유니 – 1로 지정), HA, 융합 펩타이드 6만이 보편적으로 보존 에피토프에서 확인되었다 N – 말단 다른 클로즈 (HCA – 3으로 지정) 7. 이러한 아미노산 시퀀스와 펩티드가 합성과 항체 생산에 대한 토끼 면역에 사용되었습니다. HA의 유니 – 1 에피토프에 대한 항체는 HCA – 2 및 NA의 HCA – 3 지역에 대한 항체가 모든 9 NA의 subtypes를 바인딩 수있는 동안 인플루엔자 HA (H1 – H13) 13 subtypes에 바인딩할 수있었습니다. 모든 항체는 allantoic 단백질에는 교차 반응이 발견되지 않은 것을 관찰에 의해 입증 바이러스 시퀀스에 대한 놀라운 특이성을 보여주었다. 이러한 보편적인 항체 그런 다음 특정 antisera 7,8없이 인플루엔자 백신의 HA와 NA를 정할 슬롯 얼룩 assays을 개발하는 데 사용되었습니다. 백신 샘플은 다양한 농도로 희석 참조 표준과 함께 슬롯 얼룩 장치를 사용하여 PVDF 막에 적용되었습니다. HA의 감지, 샘플 및 표준은 먼저 희석되었다 트리스 버퍼 NA의 측정을 위해 그들이 이러한 조건으로 Zwittergent 0.01 %를 포함하는 TBS의 희석 동안 4M 요소를 포함하는 호수 (TBS)이 크게 검출 감도를 향상되었습니다. 각각의 보편적인 항체와 immunoblotting하여 HA와 NA의 항원의 검출에 따라 신호 강도가 densitometry로 계량되었습니다. 백신의 HA와 NA의 금액은 다음 사용하는 참조의 다양한 농도의 신호 강도와 설립 표준 곡선을 사용하여 계산되었다.
이러한 항체가 HA 또는 NA에서 유니버설 epitopes에 바인딩되는 감안할 때, 관심이 조사는 슬롯 얼룩 이외 immunoassays 연구 도구로 그들을 사용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
이 두 표면 단백질은 면역 반응을 유도 6-11에게 가장 중요한 요소이기 때문에 바이러스 인플루엔자 바이러스는 HA와 NA의 양적 결정은 백신 연구 및 개발을 위해 중요하다. 이러한 단백질의 검출 이전에 보고된 면역 방법은 스트레인 특정 항체를 필요로합니다. 항체가 자신의 유일한 보편적으로 보존 epitopes 6-8을 인식 때문에 HA와 NA 항원 여기에 설명된 내용을 계량하는 간?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고의 광고 문안 검토를 위해 부인 모니카 Tocchi 감사하고 싶습니다. AMH가 캐나다에서 사우디 아라비아 문화 협회를 통해 킹 Abdulaziz 대학에서 장학금으로 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
Riferimenti
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
- Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
- Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
- Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
- Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
- Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
- Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
- Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
- Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
- Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , (2010).
