Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot
Summary
Une méthode simple fente blot a été développé pour la quantification de l'hémagglutinine de la grippe virale et la neuraminidase utilisant des anticorps ciblant universelle leurs séquences les plus conservées identifiées par l'analyse bioinformatique. Cette approche innovatrice pourrait fournir une alternative utile pour la détermination quantitative de tous hémagglutinine et la neuraminidase virale.
Abstract
L'hémagglutinine (HA) et neuraminidase (NA) sont deux protéines de surface du virus de la grippe qui sont connus pour jouer un rôle important dans le cycle de vie du virus et l'induction de réponses immunitaires protectrices 1,2. Comme la principale cible des anticorps neutralisants, HA est actuellement utilisé comme marqueur de la puissance et le vaccin contre la grippe est mesurée par immunodiffusion radiale simple (SRID) 3. Cependant, la dépendance de SRID sur la disponibilité des immunsérums correspondants sous-type entraîne un minimum de 2-3 mois de retard pour la sortie de chaque nouveau vaccin. Par ailleurs, malgré les preuves que NA induit aussi une immunité protectrice 4, le montant de NA vaccins contre la grippe n'est pas encore standardisé en raison d'un manque de réactifs appropriés ou méthode analytique 5. Ainsi, de simples méthodes alternatives permettant de quantifier les antigènes HA et NA sont souhaitables pour une libération rapide et un meilleur contrôle de la qualité des vaccins antigrippaux.
Régions universellement conservées dans tous la grippe A disponible HA et NA séquences ont été identifiés par analyse bioinformatique 6-7. Une séquence (désigné comme Uni-1) a été identifié dans l'épitope ne universellement conservé de la HA, le peptide de fusion 6, tandis que deux séquences conservées ont été identifiées dans les neuraminidases, un proche du site enzymatique actif (désigné comme HCA-2) et le autre près de la N-terminale (désigné comme HCA-3) 7. Peptides avec ces séquences d'acides aminés ont été synthétisés et utilisés pour immuniser des lapins pour la production d'anticorps. L'anticorps dirigé contre l'épitope Uni-1 de HA a été en mesure de se lier à 13 sous-types de la grippe A HA (H1-H13) alors que les anticorps contre le HCA-2 et HCA-3 régions de NA ont été capables de se lier tous les 9 sous-types NA. Tous les anticorps ont une spécificité remarquable contre les séquences virales comme en témoigne le constat que pas de réactivité croisée aux protéines allantoïdien a été détectée. Ces anticorps ont ensuite été utilisés universelle pour développer des essais slot blot pour quantifier HA et NA dans les vaccins de grippe A sans la nécessité d'antisérums spécifiques 7,8. Échantillons de vaccin ont été appliquées sur une membrane de PVDF en utilisant un appareil de slot blot ainsi que des normes de référence dilué à différentes concentrations. Pour la détection de HA, les échantillons et les standards ont d'abord été dilué dans une solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant de l'urée 4M tandis que pour la mesure de l'AN, ils ont été dilués dans du TBS contenant 0,01% Zwittergent que ces conditions a considérablement amélioré la sensibilité de détection. Suite à la détection de l'HA et NA antigènes par immunoblot avec leurs anticorps universel, intensités du signal ont été quantifiées par densitométrie. Montants des HA et NA dans les vaccins ont ensuite été calculées en utilisant une courbe standard établie avec les intensités du signal des différentes concentrations des références utilisées.
Étant donné que ces anticorps se lient à des épitopes universel en HA ou NA, les enquêteurs intéressés pourraient les utiliser comme outils de recherche dans les immunoessais autre que le slot blot seulement.
Protocol
Discussion
La détermination quantitative de la grippe virale HA et NA sont essentiels pour la recherche de vaccins et le développement depuis ces deux protéines de surface sont plus importants composants viraux induire des réponses immunitaires 6-11. Auparavant rapporté des méthodes immunologiques pour la détection de ces protéines nécessitent anticorps spécifique à la souche. La méthode slot simple, reproductible et rapide blot pour quantifier les antigènes HA et NA décrits ici sont adaptés à tous la gr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Mme Monika Tocchi pour révision éditoriale du manuscrit. AMH est soutenu par une bourse de l'Université King Abdulaziz, à travers le Bureau culturel saoudien au Canada.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
Riferimenti
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