Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung
Summary
Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.
Abstract
Dendritische Zellen (DCs) können als Wächter des Immunsystems, die eine kritische Rolle bei der Einleitung und Reaktion auf eine Infektion 1 sein. Nachweis von pathogenen Antigen, das durch naive DCs wird durch pattern recognition receptors (PRR), die in der Lage, bestimmte konservierte Strukturen bezeichnet als pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) zu erkennen sind. Erkennung von PAMPs von DCs löst eine intrazelluläre Signalkaskade führt deren Aktivierung und Umwandlung zu reifen DCs. Dieser Prozess wird in der Regel durch die Produktion von Typ-1-Interferon gemeinsam mit anderen proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet ist, Hochregulation von Zelloberflächenmarker wie MHCII und CD86 und Migration der reifen DC zu drainierenden Lymphknoten, wo die Interaktion mit T-Zellen löst die adaptive Immunantwort 2, 3. So verlinken DCs der angeborenen und adaptiven Immunsystem.
Die Fähigkeit, die zugrunde liegenden molekularen Netzwerke DC Reaktion auf verschiedene Krankheitserreger sezieren ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Regulation dieser Signalwege und ihrer induzierten Gene. Es sollte auch dazu beitragen, die Entwicklung von DC-basierte Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten und Tumoren. Allerdings hat diese Linie der Forschung ist stark von der Schwierigkeit der Transfektion von primären DCS 4 behindert.
Virus Transduktion Methoden, wie die lentiviralen Systems werden in der Regel verwendet, tragen aber viele Einschränkungen wie Komplexität und bio-Ex-Risiko (mit den damit verbundenen Kosten) 5,6,7,8. Darüber hinaus erhöht die Lieferung von viralen Genprodukte die Immunogenität dieser transduzierten DCs 9,10,11,12. Die Elektroporation wurde mit gemischten Ergebnissen 13,14,15 verwendet worden, aber wir sind die ersten, die Verwendung einer High-Throughput-Transfektionsprotokolls Bericht und schlüssig nachweisen seine Nützlichkeit.
In diesem Bericht fassen wir ein optimiertes Protokoll für die kommerziellen High-Throughput-Transfektion von primären humanen DCs, mit begrenzten Zelltoxizität und das Fehlen von DC Reifung 16. Transfektionseffizienz (von GFP-Plasmid) und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mehr als 50% bzw. 70%. FACS-Analyse wurde das Fehlen Erhöhung der Expression der Reifung Marker CD86 und MHCII in transfizierten Zellen, während qRT-PCR zeigte keine Hochregulation von IFNβ. Mit dieser Elektroporation Protokoll, bieten wir Beweise für eine erfolgreiche Transfektion von DCs mit siRNA und effektive knock down von gezielten Gen RIG-I, ein wichtiger viraler recognition receptor 16,17, sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.
Protocol
Discussion
Effiziente Transfektion von primären naiven dendritischen Zellen ist für hohen Durchsatz-Analyse und Reverse Engineering von zellulären Entzündungswege in diesem wichtigen Zell-Vermittlung der angeborenen-adaptive Immunsystem Übergang wichtig. Allerdings finden die meisten Forscher, dass diese Zellen nur schwer effizient und ohne die Transfektion induzieren Zellreifung transfizieren bei der Verwendung von Standard-Transfektion Techniken sind. Wir untersuchten, ob diese Einschränkungen, die im Hochdurchsatz-Protoko…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Projekt wurde vom NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C unterstützt. Wir danken Ming Chen für seine technische Unterstützung.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
Riferimenti
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
