C di vivo Lazer Axotomy elegans

1. Sistem montajı Sisteminin belirli bileşenleri aşağıda özetlenmiştir. Doğru montaj yapıldığında, kullanıcının tek elle mikroskop odaklanmak gerekir, (ya fare, joystick ile) ile sahneye taşımak, ayak pedalı ile lazer etkinleştirin ve üzerinde net bir görüş var ekran görüntüsü. MicroPoint lazer epi-floresans bir bileşik mikroskop bağlantı noktasına monte edilebilir. Biz Nikon 80i kullanabilirsiniz, ancak, herhangi bir araştırma notu Dik veya ters çevrilmiş kapsamı çalışması gerekir. MicroPoint sistemi kesmek istediğiniz hücreleri etiketler fluorofor maç gereken özel bir dikroik içerecektir. Alternatif fluorophores etiketli Kesme hücreleri ek dichroics gerektirir. Ayrıca, bir darbe jeneratörü ve ayak pedalı MicroPoint sistemi ile geliyor. 100x, 1.4 NA yağ performans cerrahi ve yenilenme değerlendirilmesi için objektif, artı slayt örnek bulmak için gerekli ek hedefler. Biz ameliyatı için bir Nikon Planı Apo VC ve 4x kaba odaklama ve örnek bulmak için yararlı olduğunu bulmak. Joystick ile sahne Motorlu. Sahnede sadece hedefleme için kullanılan bu yana, son derece yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile bir aşamasında, gereksiz. Biz önce OptiScan II (tartışma) kullanın. Kamera. Kamera, bilgisayar monitörü görüntü görselleştirme 100x amacı ile etiketlenmiş neurite, odak ve hedef yeterli bir kare hızı sağlamak için ihtiyaç. Biz axotomy prosedürü sırasında aydınlatma ışığı azaltıcı (aşağıda, 1.7 bakınız) foto ağartma veya hasar potansiyel karıştırıcı etkilerini önlemek için tercih ediyor. Böylece, fotoğraf makinesi, bu düşük ışık seviyesini karşılamak için yeterince duyarlı olması gerekir. Biz Hamamatsu Orca 05G kullanımı ve 16.3 Hz görüntüleme yeterli olduğunu bulmak. Eşdeğer kameralar yerine olabilir. Kamera sürücü, Bilgisayar, monitör, ve görüntüleme yazılımı. Ayrıca, (tartışma), bir fare ile motorlu sahne işlemek için görüntüleme yazılımı kullanın. Hava tablo. Bu gereklilik, yere bağlı olarak değişebilir, fakat cerrahi 100x amacı ile yapılır, titreşim izolasyonu gerekli buluyorum. Fluorofor aydınlatan ışık kılavuzu ve obtüratör mekanizması ile Işık kaynağı. Işık kılavuzu MicroPoint eklenecektir. Obtüratör mekanizması bağımsız lazer aydınlatma yoğunluğunu azaltmak için yararlıdır. Biz önce Lümen 200 veya Leica EL6000 kullanımı ve axotomy toplam ışık yoğunluğu% 80 kadar zayıflatır. 2. Lazer kurulum Ayrıntılı bir protokol başlangıçta hizalayın ve lazer odak MicroPoint lazer sistemi ile sağlanmaktadır. Biz ilk kurulum prosedürü üzerine başarılı bir şekilde takip edilmiştir varsayalım. Bu lazer mercek crosshair'i ile hizalayarak içerir. Burada lazer odak ve yoğunluğu düzenli bakım için bir protokol sağlar. MicroPoint kılavuzda belirtildiği gibi, darbeli azot lazer insan gözü ciddi zarar verme yeteneğine sahiptir. Bakım lazer ışını doğrudan bakmak asla alınmalıdır. Kurulduktan sonra, bariyer filtresi güvenle göz mercekleri ile radyasyon engellemeniz gerekir. Bir organizmanın nöronlar Kesme kum tanesi büyüklüğü zor olabilir. Lazer tarafından yapılan hasar alan çok küçük olduğundan, bu örnek tam hedef için üç boyutlu lazer odak konumunu bilmek şarttır. Lazer odak yansıtılmış slayt kullanılarak bulunur. İlk olarak, lazer odak z konumu görüntüleme yolunu odak eşleşen olmadığını kontrol edin. Daha sonra, hasar odak xy konumu görüntüleme yazılımı crosshair'i ile işaretlenir. Z-düzlemi yoğunlaşırken Nötral yoğunluk filtresi ND16 (Şekil 1a) itin. Biz netleme sırasında lazer azaltmak için epi-aydınlatma yolunda nötral yoğunluk filtreleri kullanın. Daha ince odaklanarak, ND16 ve ND4 floresan filtreleri hem itin. Anahtarı ile 1 darbe MicroPoint lazer 'Seç' (Şekil 1b), ve daha sonra uygun bir uzun geçiş bariyer filtresi (Şekil 1c) filtre tekerleği hareket döndü. Sahneye yansıtılan slayt yerleştirin ve iletilen ışık kullanarak 4X amacı ile içinde iğne deliği odaklanmak. Yansıtılmış slayt bir damla immersiyon yağı ekleyin ve 100X amacı ile iğne delikleri üzerinde odaklanılması. Ile kamera deklanşör kolu (Şekil 1d) ve lazer çekim hızı (Şekil 1e) anahtarlama optik yol açın. Gerekirse iğne deliği kenarları keskin, bu yüzden iletilen ışık yoğunluğunu azaltmak: Bu tam olarak odaklama yardımcı olacaktır. Ayak pedalı basın. Bu ayna lazer düzgün odaklı ise küçük bir delik üretmek gerekir. Yansıtılmış slayt düzlemi biraz üstünde mikroskop Focus ve lazer tekrar ateş. Bu daha küçük yapmak gerekirilk atış daha delik, ya da hiç iz bırakmak. Yansıtılmış slayt altında yoğunlaşarak tekrarlayın. Bir delik 2.5 veya daha büyük bir delik üretilen ayna yüzeyi altında veya üstünde duruluyor ise, lazer ablasyon baş odak halkası ile tekrar odaklayın. Delik hala düzgün merceğindeki crosshair'i ile uyumlu olduğunu doğrulayın. Tutarlı kullanımı ile, z-düzlemi odak nadiren ayarlanması gerekiyor. Xy düzleminde yoğunlaşırken Yukarıda 2.3 üzerinden 2.1 adımları izleyin ve küçük bir delik ayna slayt yapmak için ayak pedalına basın. Başlatın menüsü Elements 'Acquire' çekim modu 'Canlı'. 'Ölçü' araç 'seçeneğini ROI editörü', sonra 'çift çapraz' aracını seçin ve yeni deliğin merkezi ile hizalamak crosshair'i sürükleyin. Ve daha sonra 'Çıkış editörü' ROI Kaydet 've canlı çekim modu devam tıklayın. Fare ile sahne işlemek için Elements 'fare XY' ayarı etkinleştirin. Nötral yoğunluk filtresi (ler), orijinal pozisyonuna (lar) geri çekin 10 lazer bakliyat ve yansıtılmış slayt kaldırmak. Lazer güç ayarlama Lazer güç seçtiğiniz nöron kesmek için gerekli olan minimum gücü ayarlanabilir olmalıdır. Yaşayan solucanlar (aşağıda açıklanmıştır) kesim ise zayıflatıcı plaka (Şekil 1f) hareket ederek güç ayarlayın. Lazer gücü çok yüksek ise, bu çevresel hasara neden olan veya solucan bir delik patlama olacak. Lazer gücü çok düşükse, nöron sever. Sistem kurulduktan sonra, zayıflatıcı pozisyonu nadiren değiştirilmesi gerekir. Lazer zayıflarsa, zayıflatıcı plaka kesme devam taşındı ihtiyacı varsa, boya hücre boya değiştirilmesi gerekir (bakınız tartışma) bir işareti olabilir. 3. Solucanlar hareketsiz % 3 M9 erimiş agaroz, 22mm KH2PO4, 42mm Na2HPO4, 85mm NaCl, 1mm MgSO4 bir çözüm hazırlayın. Erimiş agaroz 5 ml, 15 ml şahin tüp içine koyun. Başka bir tüp su ile doldurun. Modüler bir gözü Yeri tüpler 55 ° C'ye kadar Her tüp için mini su banyoları oluşturmak için gözü su ile doldurun. Not: agaroz büyük miktarlarda önceden hazırlanan ve daha sonraki deneyler için yeniden erimiş olabilir. Etiketleme bant her iki slaytlar ve bu slaytları arasında temiz bir slayt iki kat yerleştirin. Temiz slayt ve sonucu agaroz pad (Şekil 2) iki adet bant kalınlığı, böylece ilk yer dik başka bir slayt ortasında plastik bir ampul pipet kullanarak agaroz bir damla koyun. 30 saniye sonra yastık iki slaytları teker teker çıkarın. Durulayın ve plastik pipet sonraki slaytlar ile kullanmak için, su dolu bir şahin tüp içinde saklayın. Sonra, yer 3-5 ped merkezinde 0.10 mm veya 0.05 mikron polistiren boncuklar mcL. 5-10 solucanlar ilgi nöronların floresan proteini ifade ekleyin. Ilgi nöronların asimetrik solucanın sağ veya sol tarafında dağıtılan platin alma, solucanlar doğru tarafı yukarı bakacak şekilde çevirmek için kullanın. Worms agaroz pedleri hazırlanması 10 dakika içinde slaytlar konulmalıdır. Solucanlar bir kapak kayma dikkatlice yerleştirin. Kapak kayma yerleştirildikten sonra, bu manikür bozabilir ve solucanları yok edecektir agaroz pad göre hareket yok. Mikroskop aşamasında hazırlanan slayt yerleştirin. 4. Kes nöronlar Optik yol geçiş kolu ile göz mercekleri içine doğrudan güneş ışığı. 4X amacı ile kesilebilir solucan odaklanın kapak astar üzerine petrol bir damla yerleştirin ve 100X amacı geçmek. Kamera optik yol dönün. Crosshair'i merkezinde altında seçtiğiniz nöron taşımak için fareyi kullanın. Lazer yangın ayak pedalına basın ve nöronal süreci sever. Gerekirse, bakliyat iki takım nöron koparmak için kullanılabilir. İlk başta, bu nöronların sonraki rejenerasyon değerlendirmek için bireysel solucanlar kesilmiş sahip olduğu tam olarak takip etmek için yararlı olur. Doğru yapıldığında, lazer axotomy çevresindeki cilt dokusu veya diğer nöronların (bkz. Şekil 3) önemli bir hasara neden olmadan, nöron küçük bir mola üretir. Bazı durumlarda, küçük bir iz, site çevresinde yaralanma meydana gelebilir. Solucanlar agaroz pad üzerinde kalmasını dikkatli olmak, doğrudan yukarı doğru hareketi kapak kayma kaldırarak solucanlar kurtarın. Lamel kapalı slayt yapmayın. Sonra, iğne burun forseps ile solucanlar etrafında ped kesmek ve OP50 8 içeren taze bir numaralı seribaşı NGM plaka agaroz bölümüne yerleştirin . Boncuk solucanlar ücretsiz ve agaroz kaldırmak için steril M9 10 mcL pad üzerinde yerleştirin. 5. Puan nöron rejenerasyonu için Agaroz adım 2.2 'de belirtildiği gibi, dolgusunu hazırlayın. 3-5 ve Yeri solucanlarmu; polistiren boncuklar L. Lamel uygulayın. Slaytlar sırayla hazırlıklı olmak, ya da alternatif tüm solucanlar, avans ve 10 cm kültür yemekleri, her agaroz nemli tutmak için nemli bir Kimwipe içeren muhafaza slaytlar hazırlanmış olabilir. 100X amacı kopmuş nöronlar görselleştirmek için kullanın. Birçok nöronlar, kesme sitesi distal nöronal güdük kalacaktır. Biz bu kalıntının varlığı gerçekten nöron (Şekil 4) kopmuş olduğunu bir göstergesi olarak kullanırlar. Bu güdük varlığı kesmeyin kesilen ve yeniden bir nöron ayırt etmek mümkün kılar. Not: her iki distal ve proksimal kütükleri başlangıçta kesildikten sonra geri çekin. Rejenerasyon değerlendirin. Çeşitli parametreler tespit edilebilir. Bir basit test yaralı nöron bir büyüme konisi oluşmuş (Şekil 4a) ve (Şekil 4b) rejenere olup olmadığını, ya da. Alternatif olarak, neurite süresini izlenebilir ve karşılaştırılabilir. 6. Temsilcisi sonuçları Bir örnek olarak, γ-amino butirik asit (GABA), motor nöronların yenilenme karakterizasyonu açıklar. Bu nöronlar ventral sinir kablosunu ikamet ve dorsal sinir kablosu dairesel süreçleri uzatmak, 9 doğru hareketlilik için gereklidir. GABA nöronlar unc -47 veya unc -25 rehberleri (C. elegans Genetik Merkezi'nden suşlar sırasıyla EG1285 ve CZ1200, kontrol altında, yeşil floresan proteininin (GFP), genetik olarak kodlanmış bir florofor ifade ederek görüntülenebilmekte .) Dağı L4-aşamada solucanlar açıklandığı gibi, solucanlar, sağ tarafta GABA nöronlar bakacak şekilde çevirin ve kapağı kayma bir yer. Dorsal ve ventral kabloları arasında her solucan, yarıda arka commissures 1-3 kesin. Ile çapraz veya bu gibi diğer commissures, salkımlı sonra puanı zor olduğunu commissures kesme kaçının. Açıklandığı gibi solucanlar kurtarın. Başarılı axotomy 18 ila 24 saat sonra, solucanlar, ameliyat sonrası iyileşti ve normal lokomotor ve yumurtlama davranışlar sergilemek olacaktır. Ölü ya da hasta olan solucanlar atın. Açıklandığı gibi kalan remount ve yenilenme değerlendirmek. Biz genellikle başına en az 30 kesilmiş nöronlar deneysel durumu değerlendirmek üzere hedefliyoruz. OxIs12 hayvanlarda genellikle kopmuş L4 GABA nöronların% 60-70 oranında bir büyüme konisi yapısı, bir ucu ve birkaç neurite şube uzantısı membran genişletilmesi ve kesme sitesi (Şekil 4a) göç kanıtladığı başlatmışlardır. Birçok durumda, büyüme konileri, dorsal sinir kablosu, bir komşu nöronal komissür ya da distal güdük yeniden göç etmiş. Nöron Geriye kalan% 30 ya axotomy site proksimal güdük oluşturan büyüme başlattık, ya da sadece küçük filopodia (Şekil 4b) genişletilmiş olacak. Şekil 1. UV lazer axotomy sistemi darbeli. Özgül bileşenleri şunlardır: (a) ND filtre, (b) darbe seçici (c) filtre tekerleği kolu (d), kolu (e) lazer deklanşör ve (f) zayıflatıcı plaka geçiş optik yol. Şekil 2. Agaroz ped hazırlanması. Istenilen kalınlıkta bir agaroz yastık hazırlamak için, iki kat bant (yeşil) iki slaytlar üzerine yerleştirilir. Bir slayt ilk iki arasına yerleştirilir ve agaroz bir damla, sonra temiz bir slayt eklenir. Son olarak, dördüncü bir slayt, iki adet bant kalınlığı, bir yastık içinde ilk üç dik olarak yerleştirilir. Şekil 3. Temsilcisi GABA nöron axotomies. Tipik bir deneyde, GABA nöron commissures solucanın lateral ortasında kesilmiş. Hemen önce (sol panel) ve (sağ panel) axotomy sonra kopmuş komissür gösterilmiştir. Tüm görüntüler 100X petrol amacı ile alınmıştır. Şekil 4. GABA nöron axotomies Temsilcisi sonuçlar. 24 saat sonrası axotomy kopmuş aksonların rejenerasyonu için attı. (A) olmayan rejenere akson (b) (ok) proksimal güdük olarak görülür bir büyüme konisi (ok) ile rejenere akson gösterilmiştir. Her kesim aksonun distal güdük her paneli (ok ucu) gösterilir ve akson kopmuş olduğunu bir göstergesidir.