JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Published: May 19, 2011
doi:
10.3791/2707
, ,
1Department of Genetics, Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair,Yale University School of Medicine

Summary

بروتوكول لخفض الخلايا العصبية في<em> C. ايليجانس</em> مع تقدم ليزر نابض MicroPoint. نحن تصف وضع النظام ، شل حركة الديدان ، وقطع الخلايا العصبية المسماة. وتشمل مزايا نظام منخفض التكلفة نسبيا ، والقدرة على قطع العمليات العصبية أو خلايا يجتذ<em> في الجسم الحي</em>.

Abstract

الخلايا العصبية التواصل مع الخلايا الأخرى عبر محاور عصبية والتشعبات ، وتمديد غشاء نحيلة التي تحتوي على التخصصات ما قبل أو ما بعد متشابك. في حالة تلف الخلايا العصبيه بسبب الاصابة أو المرض ، فإنه قد تتجدد. العوامل الذاتية وخلية خارجي تؤثر على قدرة الخلايا العصبية على تجديد واستعادة وظيفة. في الآونة الأخيرة ، والديدان الخيطية C. كما برز ايليجانس كائن نموذجا ممتازا لتحديد الجينات ويشير المسارات التي تؤثر على الخلايا العصبية تجديد 1-6. الطريقة الرئيسية للشروع في تجديد الخلايا العصبية في C. ايليجانس هو الليزر بوساطة القطع ، أو axotomy. خلال axotomy ، هو قطعت عملية fluorescently باستخدام الخلايا العصبية التي تحمل علامات عالية الطاقة البقول. في البداية ، وتجديد الخلايا العصبية في C. تم فحص ايليجانس باستخدام الليزر الفيمتو ثانية تضخيم 5. ومع ذلك ، فقد أظهرت دراسات لاحقة التجديد التي يمكن استخدامها ليزر نابض التقليدية لقطع بدقة الخلايا العصبية في الجسم الحي ، واستثارة رد فعل مماثل التجدد 1،3،7.

نقدم بروتوكول للأداء في الجسم الحي ليزر في axotomy الدودة باستخدام MicroPoint نابض الليزر ، ونظام تسليم المفتاح الذي يتوفر بسهولة والتي تم استخدامها على نطاق واسع لاجتثاث الخلايا المستهدفة. وصفنا محاذاة الليزر ، وتركيب والديدان ، وقطع الخلايا العصبية محددة ، وتقييم التجديد اللاحقة. يوفر النظام القدرة على خفض أعداد كبيرة من الخلايا العصبية في الديدان متعددة خلال تجربة واحدة. وبالتالي ، ليزر axotomy على النحو الموصوف هنا هو وجود نظام فعال لبدء وتحليل عملية التجدد.

Protocol

1. نظام تجميع وأوجز مكونات محددة من نظامنا أدناه. عند تجميعها بشكل صحيح ، يجب أن يكون المستخدم قادرا على التركيز المجهر بيد واحدة ، حرك المرحلة مع الآخر (إما باستخدام الماوس أو ذراع التحكم) ، وتفعيل ليزر مع دواسة القدم ، ويملك رؤية واضحة للعلى صورة الشاشة. شنت MicroPoint الليزر إلى المنفذ من برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر المركب. نستخدم 80i نيكون ، ولكن أي مجال البحوث الصف تستقيم أو مقلوب يجب أن يعمل. سيقوم النظام MicroPoint تشمل مزدوج اللون المخصصة ، والتي يجب أن تطابق fluorophore أن التسميات الخلايا التي ترغب في خفض الانتاج. قطع الخلايا المسمى مع fluorophores البديل يتطلب dichroics إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، مولد النبض ودواسة القدم تأتي مع نظام MicroPoint. 100X ، NA النفط 1.4 موضوعية لتقييم أداء الجراحة والتجديد ، بالإضافة إلى أهداف أخرى حسب الضرورة لتحديد موقع العينة على الشريحة. نستخدم خطة نيكون آبو VC لعملية جراحية ، وجدت أن من المفيد 4X للتركيز الخشنة والعثور على العينة. بمحركات المسرح مع عصا التحكم. مرحلة بدقة عالية للغاية ، والتكرار غير ضروري ، حيث يستخدم فقط لاستهداف المرحلة. نستخدم قبل OptiScan الثاني (انظر المناقشة). الكاميرا. الكاميرا يحتاج إلى توفير الإطار معدل كافية على التركيز واستهداف neurite المسمى مع هدف 100X ، بينما تصور الصورة على شاشة الكمبيوتر. نحن نفضل التخفيف ضوء إنارة أثناء إجراء axotomy لتجنب الآثار المحتملة من الخلط الصور التبييض أو الضرر (انظر 1.7 أدناه). وبالتالي ، فإن الكاميرا تحتاج إلى أن تكون حساسة بما يكفي لاستيعاب هذا المستوى الضوء المنخفض. نستخدم أوكرا هاماماتسو 05G ، وجدت أن 16.3 في التصوير هرتز كافية. ويمكن أن تكون بديلا الكاميرات ما يعادلها. الكمبيوتر ، ورصد وتصوير البرامج التي يمكن ان تدفع الكاميرا. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نستخدم برامج التصوير لمعالجة المرحلة بمحركات مع ماوس (انظر المناقشة). الهواء الجدول. هذا الشرط قد تختلف تبعا للموقع ، ولكن لأن الجراحة مع الهدف 100X ، نجد العزلة الاهتزاز على أنها ضرورية. العرض الضوء مع توجيه الضوء وآلية مصراع الكاميرا لإلقاء الضوء على fluorophore. وسوف دليل ضوء نعلق على MicroPoint. آلية مصراع مفيد للحد من شدة الإضاءة بشكل مستقل عن ليزر. نستخدم التجويف قبل 200 أو لايكا EL6000 ، وتخفيف ما يصل الى 80 ٪ من مجموع لشدة الضوء axotomy. 2. الإعداد ليزر ويرد بروتوكول مفصلة لمواءمة والتركيز في البداية ليزر مع نظام ليزر MicroPoint. نحن نفترض اتبعت هذا الإجراء بنجاح على الإعداد الأولي. ويشمل هذا مواءمة مع الليزر في مرمى العدسة. نقدم هنا بروتوكولا للصيانة العادية للتركيز الليزر والكثافة. كما لوحظ في دليل MicroPoint ، ليزر نابض النيتروجين قادرة على إلحاق أضرار بالغة في العين البشرية. وينبغي الحرص على عدم النظر مباشرة في شعاع الليزر. تثبيت مرة واحدة ، ينبغي للمرشح كتلة حاجز الإشعاع بأمان من خلال العدسات. قص الخلايا العصبية في كائن حي يمكن أن حجم حبة الرمل أن يكون تحديا. لأن منطقة الأضرار التي ليزر صغيرة جدا ، لا بد من معرفة موقع ثلاثي الأبعاد لتركيز الليزر من أجل استهداف العينة بدقة. تم العثور على تركيز الليزر باستخدام الشريحة معكوسة. أولا ، علينا التحقق من أن الموقع ض للتركيز الليزر مباريات تركيز مسار التصوير. المقبل ، ويتميز الموقع XY من الضرر مع التركيز مرمى في برنامج التصوير. التركيز في Z – الطائرة دفع في ND16 تصفية محايدة الكثافة (الشكل 1A). نستخدم مرشحات الكثافة محايدة في مسار البرنامج الموسع للتمنيع ، لتخفيف الإضاءة والليزر ، مع التركيز. حتى لأدق التركيز ، ودفع في كل من المرشحات وND16 ND4 الفلوريسنت. تحولت مجموعة الليزر MicroPoint إلى 1 النبض مع التحول إلى "اختيار" (الشكل 1B) ، ومن ثم تحريك عجلة فلتر لتصفية المناسبة حاجز طويل تمرير (الشكل 1C). مكان الشريحة تنعكس على المسرح ، والتركيز على الثقوب في داخلها بهدف 4X باستخدام الضوء المنقولة. إضافة قطرة من زيت الغمر إلى الشريحة معكوسة وإعادة التركيز على الثقوب بهدف 100X. فتح مصراع الكاميرا مع تبديل مسار بصري رافعة (1D الشكل) ومصراع الليزر (الشكل 1E). إذا لزم الأمر ، والحد من كثافة الضوء المرسل حتى حواف الثقوب واضحة : سوف تركز هذه المساعدات في بالضبط. اضغط على دواسة القدم. هذا يجب أن ينتج ثقب صغير في المرآة إذا ركزت ليزر بشكل صحيح. التركيز المجهر أعلى قليلا من طائرة من الشريحة معكوسة واطلاق النار ليزر مرة أخرى. هذا يجب إجراء أصغرحفرة من النار أولا ، أو ترك أي علامة على الاطلاق. كرر بالتركيز أدناه الشريحة معكوسة. إذا لم يتم إنتاجها في حفرة 2.5 ، أو إذا كان يتم إنتاج أكبر ثقب عندما تركز فوق أو تحت سطح المرآة ، وإعادة تركيز الليزر مع عصابة التركيز على رأسه الاجتثاث. تحقق من أن لا تزال الحفرة بشكل صحيح مع محاذاة في مرمى العدسة. مع الاستخدام المتواصل ، فإن التركيز ض الطائرة نادرا ما يحتاج إلى تعديل. التركيز في الطائرة س ص اتبع الخطوات من 2.1 خلال 2.3 أعلاه واضغط على دواسة القدم لإحداث ثقب صغير في الشريحة المرآة. بدء "لايف" القبض على النمط من "الحصول على" عناصر القائمة. في "قياس" اختر شريط "ROI محرر" ، ثم حدد الأداة "عبر المزدوجة" واسحب مرمى لمواءمتها مع مركز الثقب جديدة. انقر على "حفظ ROI' ثم 'محرر إنهاء" واستئناف ايف وضع الالتقاط. تفعيل "الماوس XY' الإعداد في عناصر لمعالجة المرحلة مع الماوس. سحب مرشح الكثافة محايدة (ق) إلى وضعه الأصلي (ق) ، وضبط نبضات الليزر إلى 10 ، وإزالة الشريحة معكوسة. تعديل قوة الليزر وينبغي تعديل قوة الليزر لسلطة الحد الأدنى اللازم لقطع الخلايا العصبية التي تختارها. ضبط السلطة بتحريك الطبق المخفف (الشكل 1F) ، في حين قطع الديدان الحية (موضح أدناه). إذا كانت قوة الليزر عالية جدا ، وسوف تسبب ضررا أو هامشية الانفجار حفرة في الدودة. إذا كانت قوة الليزر منخفض جدا ، وانها لن تقطع الخلايا العصبية. مرة واحدة وقد تم وضع هذا النظام ، فإن موقف المخفف نادرا ما يحتاج إلى تغيير. إذا كان ليزر تصبح ضعيفة ، وصفيحة المخفف يحتاج إلى أن تنقل إلى مواصلة القطع ، ويمكن أن يكون إشارة إلى أن الصبغة في الخلية الصبغة يحتاج إلى استبدال (انظر المناقشة). 3. شل الديدان يعد حل 3 ٪ agarose المنصهر في M9 (22mm و KH2PO4 ، Na2HPO4 42mM ، 85mm و كلوريد الصوديوم ، 1MM MgSO4). الاستغناء عن 5 مل من agarose المنصهر في أنبوب 15 مل الصقر. ملء أنبوب آخر مع الماء. أنابيب مكان في عنصر تسخين وحدات مجموعة إلى 55 درجة مئوية. ملء عنصر التدفئة مع الماء لإنشاء حمامات المياه مصغرة لكل أنبوب. ملاحظة : يمكن تحضير agarose بكميات كبيرة في النهوض وإعادة صهرها في تجارب لاحقة. مكان طبقتين من الشريط وضع العلامات على كل من شريحتين شريحة نظيفة وبين هذه الشرائح. الاستغناء عن قطرة من agarose باستخدام ماصة بلاستيكية لمبة منتصف الشريحة النظيفة ، ومكان آخر عمودي على الشريحة الأولى بحيث يكون الناتج agarose سادة هو سمك من قطعتين من الشريط (الشكل 2). إزالة واحدة من الشرائح اثنين من لوحة بعد 30 ثانية. شطف وتخزين ماصة بلاستيكية في أنبوب الصقر مملوء بالمياه للاستخدام مع الشرائح اللاحقة. المقبل ، ومكان 3-5 ميكرولتر من 0.10 ميكرومتر أو 0.05 ميكرومتر الخرز البوليسترين في وسط اللوحة. إضافة الديدان 10/05 التعبير عن بروتين فلوري في الخلايا العصبية في المصالح. إذا تم توزيعها بصورة غير متماثلة على الخلايا العصبية لسعر الفائدة على الجانب الأيمن أو الأيسر من دودة ، واستخدام البلاتين لالتقاط الوجه الديدان بحيث الجانب الصحيح هو مواجهة. يجب أن توضع الديدان على الشرائح في غضون 10 دقيقة من إعداد منصات agarose. المكان بعناية زلة تغطية على الديدان. بعد وضع الغطاء زلة ، فإنه لا يتحرك بالنسبة إلى لوحة agarose حيث سيؤدي ذلك إلى تعطيل وتدمير إهاب الديدان. مكان الشريحة التي أعدت حول المرحلة المجهر. 4. قص الخلايا العصبية الضوء المباشر في العدسات مع ذراع تبديل مسار بصري. التركيز على الدودة إلى قطع بهدف 4X ، ضع قطرة من الزيت على تغطية زلة ، والتحول إلى هدف 100X. عودة المسار البصري للكاميرا. استخدام الفأرة لتحريك الخلايا العصبية من اختيارك تحت وسط مرمى. اضغط على دواسة القدم لاطلاق النار وقطع ليزر عملية الخلايا العصبية. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام مجموعتين من البقول لقطع الخلايا العصبية. في البداية ، فإنه من المفيد أن تتبع بدقة والتي قطعت في الخلايا العصبية الفردية الديدان من أجل تقييم تجديد لاحقة. عندما يقوم بشكل صحيح ، ليزر axotomy تنتج كسر صغير في الخلايا العصبية دون التسبب في ضرر كبير للأنسجة الجلد المحيطة أو الخلايا العصبية الأخرى (انظر الشكل 3). في حالات معينة ، قد شكل ندبة صغيرة حول موقع الاصابة. استرداد الديدان عن طريق إزالة الغطاء زلة في الحركة صعودا المباشر ، والحرص على أن الديدان لا تزال على لوحة agarose. لا تنزلق للخارج ساترة. ثم ، وقطع لوحة في مختلف أنحاء الديدان مع إبرة ملقط الأنف ووضع قسم من agarose على طبق حديثا NGM المصنف تحتوي على OP50 8. 10 ميكرولتر من مكان M9 معقم على منصة لاطلاق سراح الديدان من الخرز وإزالة agarose. 5. الخلايا العصبية لدرجة التجدد إعداد agarose سادة على النحو المبين في الخطوة 2.2. الديدان في مكان و 3-5مو ؛ L من الخرز البوليسترين. تطبيق ساترة. يمكن تحضير الشرائح بالتسلسل ، أو بدلا من ذلك يمكن أن تكون على استعداد جميع الديدان مقدما والشرائح يوضع في أطباق ثقافة 10 سم ، تحتوي على كل Kimwipe رطبة للحفاظ على رطوبة agarose. استخدم الهدف 100X لتصور الخلايا العصبية مقطوعة. في الخلايا العصبية الكثيرة ، فإن الجذع العصبية البعيدة إلى موقع خفض ما زالت قائمة. نحن نستخدم وجود بقايا من هذا دليلا على أن بترت بالفعل الخلايا العصبية (الشكل 4). وجود هذا الجذع يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا العصبية التي تم قطعها ومجدد من أنه لم يتم خفض الانتاج. ملاحظة : كل من القاصي والداني جذوعها التراجع في البداية بعد ان قطع. تقييم التجدد. ويمكن تحديد مجموعة من المعلمات. فحص بسيط واحد هو ما إذا كانت الخلايا العصبية اصيب شكلت مخروط النمو (الشكل 4A) ومجدد ، أو لا (الشكل 4B). بدلا من ذلك ، يمكن أن تعزى neurite طول ومقارنتها. 6. ممثل النتائج كمثال على ذلك ، ونحن تصف توصيف تجديد حمض الغاما γ – (GABA) الخلايا العصبية الحركية. هذه الخلايا العصبية التي تتواجد في الحبل البطني العصب وتوسيع نطاق العمليات circumferentially إلى الحبل الظهري العصبية ، ضرورية لتحرك مناسب 9. يمكن أن الخلايا العصبية GABA يمكن تصور بالإعراب عن fluorophore المرمزة وراثيا ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، تحت سيطرة -47 -25 UNC UNC أو المروجين (سلالات EG1285 وCZ1200 ، على التوالي ، وهي متاحة من مركز الوراثية جيم ايليجانس ). جبل L4 مراحل كما هو موضح الديدان ، والوجه الديدان حتى الخلايا العصبية GABA على الجانب الأيمن ومواجهة ، ووضع انزلاق الغطاء. قطع 1-3 من commissures الخلفي في كل منتصف الطريق ، ودودة بين الحبال ظهري وبطني. تجنب قطع commissures التي تعبر أو fasciculate commissures مع الأخرى ، وهذه هي صعبة ليسجل لاحقا. استرداد الديدان كما هو موضح. 18 إلى 24 ساعة بعد axotomy ناجحة ، سوف يكون تعافى من جراحة في الديدان ومعرض locomotory العادي ووضع البيض السلوكيات. تجاهل الديدان التي هي ميتة أو مريضة. صعد مرة ثانية الباقي كما هو موضح ، وتقييم التجدد. ونحن نهدف عادة لتقييم ما لا يقل عن 30 حالة الخلايا العصبية في قطع تجريبية. oxIs12 في الحيوانات ، وبدأت عادة 60-70 ٪ من الخلايا العصبية L4 قطعت GABA هيكل مخروط النمو ، ويستدل على ذلك من توسيع غشاء على الحافة ، وتوسيع فروع neurite عدة ، وهاجر من موقع قطع الشكل (4A). في كثير من الحالات ، تكون قد هاجرت المخاريط النمو إلى إعادة الاتصال مع الحبل الظهري العصبية ، والعصبية صوار المجاورة ، أو الجدعة البعيدة. وسوف تطلق 30 ٪ المتبقية من الخلايا العصبية إما أي نمو ، وتشكيل الجذع الأقرب إلى موقع axotomy ، أو لن يكون تمديد أرجل كاذبة خيطية صغيرة فقط (الشكل 4B). الشكل 1. نابض ليزر الأشعة فوق البنفسجية axotomy النظام. مكونات محددة هي : (أ) مرشحات ND (ب) نبض محدد (ج) رافعة شوكية تصفية (د) تحويل مسار بصري مصراع ذراع الليزر (ه) و (و) لوحة المخفف. الشكل 2. إعداد لوحة agarose. لإعداد لوحة agarose من سمك المطلوب ، طبقتين من الشريط (أخضر) يتم وضعها على اثنين من الشرائح. توضع شريحة بين الأولين ، وثم يضاف قطرة من agarose إلى الشريحة النظيفة. أخيرا ، يتم وضع شريحة fourth عموديا على الثلاثة الأولى ، مما أدى إلى وسادة هذا هو سمك قطعتين من الشريط. الشكل 3. ممثل GABA axotomies الخلايا العصبية. في تجربة نموذجية ، وقطعت GABA commissures الخلايا العصبية في منتصف الجانب الوحشي من الدودة. ويرد على الفور قطعت قبل الصوار (اللوحة اليسرى) وبعد (اللوحة اليمنى) axotomy. وقد اتخذت كافة الصور مع الهدف 100X النفط. الشكل 4. ممثل نتائج axotomies عصبون GABA. وأحرز 24 ساعة بعد axotomy المحاوير قطعت على التجدد. ويرد محوار تجديد مع مخروط النمو (السهم) في الفقرة (أ) ، في حين ينظر إلى عدم تجديد محوار كما جدعة الداني (السهم) في (ب). ويرد الجدعة البعيدة كل محوار خفض في كل لوحة (رأس السهم) ، وإشارة إلى أن تم قطع محور عصبي.

Discussion

وقد استخدمت مجموعة متنوعة من نظم الليزر لقطع neurites في C. وقد درست ايليجانس ، والعديد من الدراسات أدائها بالتفصيل 3،7،10،11. MicroPoint الليزر المستخدمة في بروتوكول لدينا هو نظام تسليم المفتاح هو أن من السهل اقامة وصيانة ويتوفر بتكلفة منخفضة للباحثين بالمقارنة مع نظام الليزر TI – الياقوت. بالمقارنة مع نظام TI – الياقوت ، ومع ذلك ، فمن المتوقع أن الليزر MicroPoint أن تسبب أضرارا لأكبر مساحة ، والذي قد يكون غير ملائم لبعض التطبيقات. إذا كان المطلوب هو نظام TI – الياقوت ، بروتوكولا ممتازة لبناء مثل هذا النظام غير متوفر 12.

يمكن تنفيذ البروتوكول الحالي على مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية في C. ايليجانس ، ومع ذلك ، نلاحظ أن من المتوقع أن الاختلافات في قدرات التجدد بين أنواع متميزة من الخلايا العصبية 13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر على خلفيات مختلفة وراثيا نجاح التجدد. على الرغم من أن النسبة المئوية لتجديد الخلايا العصبية GABA يتماشى إلى حد ما بين مختلف السلالات المعدلة وراثيا علامة ، لاحظنا زيادة طفيفة في العام التجدد في juIs76 14 مقابل 15 oxIs12 الديدان. الاختلافات بين الخلايا العصبية من علامات اللمس كما وصفت 2.

نحن نفضل أن شل الديدان مع microbeads بدلا من المسكنات مثل حبات نتيجة في أسرع وأكثر اتساقا تجميد 16. وهذا هو أيضا من المفيد ونحن قادرون على مراقبة التجدد خالية من أي آثار محتملة ، بسبب الخلط تخدير 17. بديل مخدر خالية طريقة لتجميد هو استخدام أجهزة ميكروفلويديك. وقد تم استخدام axotomy على microfluidics لوصف على نطاق واسع 17-22.

نجد أن تتفق مع الاستخدام ، يتم تغيير وظائف الليزر أفضل عندما الكومارين 440 في الخلية صبغ مرة واحدة كل أسبوع بعد إجراء المبين في دليل MicroPoint. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام شريط التمرير لزيادة توهين السلطة ، ولكن هذا قد يكون مؤشرا لصبغ القديمة أو اختلال بالليزر. أيضا ، فإن الخلية صبغ له عمر محدود ، وسوف تحتاج في نهاية المطاف إلى إعادة بناء أو استبدالها (انظر استكشاف أخطاء).

قد يكون من الصعب على المناورة في neurite الهدف تحت مرمى تلك العلامة تركيز الليزر ، وخاصة إذا ما شلت غير كامل الحيوان. نجد أن مرحلة دليل ليس الأمثل لهذا الغرض ، على الرغم من أنها صالحة للاستعمال بالتأكيد. مرحلة عصا التحكم التي تسيطر عليها بمحركات أكثر دقة ، ونجد أن استخدام البرمجيات التي تدعم الصور مع سحب الماوس لتحريك الآلية المرحلة هو أفضل. عناصر نيكون يوفر هذه الميزة والموصوفة في هذا البروتوكول ، ولكن الحزمة Micromanager مجانا ، فضلا عن غيرها من البرامج والتصوير ، وربما وظيفة مماثلة. وهناك طريقة مختلفة لاستهداف غرامة لنقل التركيز الليزر ، بدلا من الحيوان. A – الجلفانومتر شعاع التوجيه الآلية المتاحة بوصفها إضافات إلى ليزر MicroPoint ، إذا كان يفضل هذا النهج.

إلى جانب تطبيقها لدراسة تجديد الخلايا العصبية ، ويمكن استخدام الليزر ليجتذ أنواع الخلايا الأخرى ، مثل العضلات والجلد ، أو خلايا متخصصة ، أو لعرقلة المشابك العصبية المحددة 23-27. وعلاوة على ذلك ، يمكن التحقيق المسارات التي تنظم تنكس الخلايا العصبية التي ترافق الإصابة أو المرض مع هذا النظام. على هذا النحو ، فإن استخدام الليزر نابض الاستمرار في إلقاء الضوء على العوامل الوراثية في كل خلية والتغيرات البيولوجية التي تسهل تجديد الخلايا العصبية والعمليات الأخرى ذات الصلة.

المشاكل :

ووصف وهنا بعض المشاكل المشتركة والحلول المرتبطة بها.

  1. الليزر ليس القطع بشكل صحيح. وهذا هو المرجح لأن الليزر هو إما للخروج من التركيز (انظر القسم 2) ، أو الصبغة في الخلية الصبغة يحتاج إلى استبدال (انظر MicroPoint يدوي). بدلا من ذلك ، قد صبغ الخلية تحتاج إلى استبدال أو إعادة بنائها.
  2. الديدان تتحرك على لوحة agarose. عموما هذه هي علامة على أن لوحة agarose رطبة جدا. نجد أن الحاجة إلى منصات أن تترك لمدة 30 ثانية تقريبا قبل أن يتم وضعها على هذه الديدان للتحايل على هذه المشكلة. يمكنك أيضا محاولة استخدام أصغر الحجم (0.05 ميكرون) microbeads.
  3. الانتعاش من الديدان أمر صعب وغير فعال. يمكن أن يكون سبب ذلك عن طريق إزالة ساترة غير صحيحة أو بواسطة وسادة agarose الجافة. إذا لوحة جافة جدا ، فقد لاحظت أن محاور تطوير مظهر مطرز. في بعض الحالات ، وهذا هو لأنه لم توضع الديدان على لوحة كافية بعد فترة وجيزة صدر فيه. بدلا من ذلك ، قد يكون المخزون القديم من حل agarose لها تركيز أعلى من 3 ٪ بعد ذوبان المتكررة.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويتم تمويل عمل في مختبر Hammarlund بواسطة : المعاهد الوطنية للصحة منح NS066082 R01 – 01 وT32GM007223 ، ومؤسسة بيكمان ، والمؤسسة الطبية إليسون.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
0.05 μm Polystyrene Beads Polysciences, Inc. 08691  
0.10 μm Polystyrene Beads Polysciences, Inc. 00876  
Agarose GPG/LE American Bioanalytical 00972 Ultra pure
Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352057 17 x 100 mm style, nonpyrogenic
Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides Erie Scientific Company 420-004T 3″ x 1″ x 1 mm
Cover Slips VWR 48366 205 18 mm x 18 mm No. 1 1/2
KIMTECH Science Kimwipes Kimberly-Clark 34155  
BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish BD Biosciences 351029  
Tape blank 3/4w x 500L TimeMed T-512  
Immersion oil Nikon   Type A, nd=1.515
EG1285 or CZ1200 C. elegans Genetic Center http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/  
OptiScan II PRIOR Scientific    
NIS-Elements Ar or Br Nikon    
MicroPoint Ablation Laser System Photonic Scientific    
Compound microscope Nikon Eclipse 80i  
Hamamatsu Camera Hamamatsu Photonics Model C8484-05G01  
Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo Dell    
Windows XP Professional   Microsoft Version 2002, Series Pack 3
Dual dry bath Incubator Fisher Scientific   Analog controls
4X Plan Fluor objective Nikon    
100X Plan Apo VC oil objective Nikon    
Dumont #5/45 forceps Dumont 11251-35 Dumoxel standard tips, can also use #7
Dissecting Microscope Nikon SMZ800 With NI-150 High Intensity Illuminator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
  2. Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
  3. Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).
  4. Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration. Cell. 138, 1005-1018 (2009).
  5. Yanik, M. F. Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
  6. Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).
  7. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).
  8. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
  9. McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans. Nature. 364, 337-341 (1993).
  10. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in. C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).
  11. Chung, S., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Applied Physics A: Materials Science & Processing. 96, 335-341 (2009).
  12. Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).
  13. Wang, Z., Jin, Y. Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology. , (2010).
  14. Huang, X., Cheng, H. -. J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion. Neuron. 34, 563-576 (2002).
  15. McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. Identification and characterization of the vesicular GABA transporter. Nature. 389, 870-876 (1997).
  16. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. . Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , .
  17. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5, 531-533 (2008).
  18. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).
  19. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  21. Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).
  22. Samara, C. Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
  23. Nelson, F. K., Riddle, D. L. Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery. Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).
  24. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Biologia dello sviluppo. 78, 577-597 (1980).
  25. Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Biologia dello sviluppo. 87, 286-300 (1981).
  26. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).
  27. Pujol, N. Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis. Current biology. CB 18, 481-489 (2008).

Tags

In Vivo Laser AxotomyC. ElegansNeuronsRegenerationModel OrganismGenesSignaling PathwaysLaser-mediated CuttingAxotomyFluorescently-labeled Neuronal ProcessFemtosecond LaserPulsed LaserMicroPoint Pulsed LaserTargeted Cell Ablation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707, doi:10.3791/2707 (2011).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image