In vivo Laser axotomy in C. elegans

1. Montage van het systeem De specifieke onderdelen van ons systeem zijn hieronder beschreven. Op de juiste wijze gemonteerd, de gebruiker moet in staat zijn om de microscoop zich met een hand, zet het podium met de andere (zowel met de muis of de joystick), moet u de laser met het voetpedaal, en hebben een duidelijk zicht op de on- beeld. Micropoint laser gemonteerd op de epi-fluorescentie-poort van een samengestelde microscoop. We maken gebruik van een Nikon 80i, maar elke research-grade rechtop of omgekeerd omvang zou moeten werken. Het Micropoint systeem omvat een aangepaste dichroic, die de fluorofoor dat de cellen die u wilt knippen etiketten moeten overeenkomen. Snijden cellen gelabeld met alternatieve fluoroforen vereist extra koudlichtspiegel. Bovendien, een puls generator en voetpedaal komen met de Micropoint systeem. 100x, 1,4 NA olie doelstelling voor het uitvoeren van een operatie en het beoordelen van regeneratie, plus aanvullende doelstellingen als noodzakelijk voor het lokaliseren van de steekproef op de dia. We maken gebruik van een Nikon Plan Apo VC voor een operatie, en vinden dat een 4x nuttig is voor grof focussen en het vinden van de steekproef. Gemotoriseerde podium met joystick. Een podium met zeer hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid is overbodig, aangezien het podium wordt alleen gebruikt voor het richten. We maken gebruik van een Prior Optiscan II (zie discussie). Camera. De camera moet zorgen voor een frame rate voldoende om zich te concentreren en de gelabelde neurieten met het 100x objectief doel, terwijl het visualiseren van het beeld op de computer monitor. Wij geven de voorkeur verzachtende de verlichting licht tijdens de axotomy procedure om potentiële verstorende effecten van foto-bleken of schade (zie 1.7 hieronder) te vermijden. Zo is de camera moet gevoelig genoeg zijn om deze verlaagde lichtniveau tegemoet te komen. We maken gebruik van een Hamamatsu Orca 05G, en vinden dat de beeldvorming bij 16.3 Hz is voldoende. Gelijkwaardige camera's kunnen worden vervangen. Computer, monitor, en imaging software die de camera kan rijden. Daarnaast gebruiken we de imaging software om de gemotoriseerde podium te manipuleren met een muis (zie discussie). Lucht tafel. Deze eis kan variëren afhankelijk van de locatie, maar sinds een operatie wordt uitgevoerd met een 100x objectief, vinden we trillingisolatie van essentieel belang. Licht te voorzien van lichtgeleider en sluitertijd mechanisme voor het verlichten van de fluorofoor. Het licht gids zal hechten aan de Micropoint. De sluiter mechanisme is nuttig om de lichtintensiteit te verlagen, onafhankelijk van de laser. We maken gebruik van een Prior Lumen 200 of een Leica EL6000, en verminderen tot 80% van het totale lichtintensiteit voor axotomy. 2. Laser setup Een gedetailleerd protocol in eerste instantie af te stemmen en de focus van de laser wordt geleverd met de Micropoint lasersysteem. We nemen aan dat de procedure met succes is gevolgd bij de eerste setup. Dit geldt ook voor het uitlijnen van de laser met het dradenkruis in het oculair. Hier hebben we een protocol voor regelmatig onderhoud van de focus van de laser en intensiteit. Zoals in de Micropoint handleiding, de gepulste laser stikstof in staat is om ernstige schade aan het menselijk oog. Zorg moeten worden genomen om nooit rechtstreeks in de laserstraal. Eenmaal geïnstalleerd, moet de barrière filter veilig te blokkeren straling door de oculairs. Cutting neuronen in een organisme ter grootte van een zandkorrel kan een uitdaging zijn. Sinds het gebied van schade door de laser is erg klein, is het essentieel om de drie-dimensionale plaats van de focus van de laser kennen om het monster precies doel. De laser focus is gevonden met behulp van de gespiegelde dia. Ten eerste, we controleren of de z locatie van de laser de focus van de focus van de beeldvorming pad wedstrijden. Vervolgens wordt de xy locatie van de schade richten gemarkeerd met kruizen in de imaging-software. Scherpstellen in de z-vlak Duw de filter met neutrale dichtheid ND16 (figuur 1a). We maken gebruik van grijsfilters in het epi-verlichting pad naar de laser verminderen tijdens het scherpstellen. Voor een nog fijnere scherpstellen, drukt u op zowel de ND16 en ND4 fluorescerende filters. Stel de Micropoint laser om een ​​puls met de schakelaar op 'Select' (Figuur 1b), en vervolgens de filter wiel te verplaatsen naar de juiste lange-pass filter barrière (figuur 1c). Plaats de gespiegelde schuiven op het podium en de focus op gaatjes in met de 4X doel met behulp van doorvallend licht. Voeg een druppel immersie olie aan de gespiegelde glijbaan en richten op gaatjes met de 100X doelstelling. Open de sluiter van de camera met het optische pad schakelen hendel (figuur 1d) en de laser sluiter (Figuur 1e). Indien nodig, doorvallend licht intensiteit te verminderen, zodat de randen van de gaatjes zijn scherpe: dit zal helpen bij het scherpstellen precies. Druk op het voetpedaal. Dit moet produceren een klein gaatje in de spiegel als de laser goed is scherpgesteld. Focus van de microscoop iets boven het vlak van de gespiegelde glijbaan en weer schiet de laser. Dit moet een nog kleinerhole dan het eerste schot, of laten geen merk aan alles. Herhalen door zich te richten onder de gespiegelde dia. Als er een gat wordt niet geproduceerd in 2,5, of als er een groter gat wordt geproduceerd bij het scherpstellen boven of onder het oppervlak van de spiegel, heroriëntatie van de laser met de scherpstelring op de ablatie hoofd. Controleer of het gat nog steeds goed is uitgelijnd met het dradenkruis in het oculair. Bij consequent gebruik, het z-vlak focus moet zelden worden aangepast. Scherpstellen in het xy-vlak Volg de stappen 2.1 tot 2.3 en druk op de pedaal om een ​​klein gaatje in de spiegel slide te maken. Starten 'Live' capture mode uit de Elementen 'Acquire' menu. In de 'Measure' toolbar selecteer 'ROI editor', selecteer vervolgens de 'dubbele kruis' tool en sleep het vizier om ze af te stemmen met het centrum van het nieuwe gat. Klik op 'Save ROI' en vervolgens 'Exit editor' en hervatten Live-opnamemodus. Activeer de 'muis XY' instelling in Elements op het podium te manipuleren met de muis. Trek het filter met neutrale dichtheid (s) terug naar de oorspronkelijke positie (s), de laserpulsen ingesteld op 10, en verwijder de gespiegelde dia. Instellen van het vermogen van de laser De kracht van de laser moet worden aangepast tot het minimum vermogen dat nodig is om de neuron van uw keuze te snijden. Stel de stroom door het verplaatsen van de demper plaat (figuur 1f) tijdens het snijden leeft wormen (zie hieronder). Als het laservermogen te hoog is, zal dit leiden tot perifere schade of ontploffing een gat in de worm. Als het laservermogen te laag is, zal het niet verbreken van de neuron. Zodra het systeem is opgezet, de verzwakker positie moet maar zelden te worden gewijzigd. Als de laser wordt zwak, en de verzwakker plaat moet worden verplaatst om verder te gaan snijden, kan het een teken dat de kleurstof in de kleurstof cel moet worden vervangen (zie discussie). 3. Immobiliseren de wormen Bereid een oplossing van 3% gesmolten agarose in M9 (22mm KH2PO4, 42mm Na2HPO4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO4). Doseer 5 ml van gesmolten agarose in een 15 ml Falcon buis. Vul een andere buis met water. Plaats de buisjes in een modulaire verwarmingselement ingesteld op 55 ° C. Vul het verwarmingselement met water om mini waterbaden voor elke buis te creëren. Opmerking: agarose kunnen worden bereid in grote hoeveelheden op voorhand en opnieuw gesmolten voor verdere experimenten. Plaats twee lagen van de etikettering tape op elk van de twee dia's en een schoon objectglas tussen deze dia's. Doseer een daling van agarose met behulp van een plastic bol pipet naar het midden van de schoon objectglas en plaats een andere dia loodrecht op de eerste, zodat de resulterende agarose pad is de dikte van de twee stukken tape (figuur 2). Verwijder een van de twee dia's van het pad na 30 seconden. Spoel en bewaar de plastic pipet in de met water gevulde falcon tube voor gebruik met de volgende dia's. Plaats vervolgens 3-5 pi van 0,10 micrometer of 0,05 micrometer polystyreen parels in het midden van het pad. Voeg 50-10 wormen uiten fluorescerend eiwit in de neuronen van belang. Als de neuronen van belang zijn asymmetrisch verdeeld over de linker-of rechterkant van de worm, gebruik dan een platina pick to wormen, zodat de juiste zijde naar boven is gericht flip. Wormen moet geplaatst worden op dia's binnen 10 minuten van de voorbereiding van de agarose pads. Plaats voorzichtig een dekglas op de wormen. Na het plaatsen van het deksel slip, niet bewegen ten opzichte van de agarose pad omdat dit de cuticula verstoren en vernietigen van de wormen. Plaats de voorbereide dia op de microscoop podium. 4. Cut neuronen Direct licht in de oculairs met de optische pad schakelen hendel. Focus op de worm te snijden met de 4x doelstelling, plaats een druppel olie op de cover slip, en overschakelen naar de 100X doelstelling. Zet de optische pad naar de camera. Gebruik de muis om het neuron van uw keuze bewegen onder het midden van het dradenkruis. Druk op het voetpedaal om de laser brand en verbreken van de neuronale proces. Indien nodig, kunnen twee sets van de pulsen worden gebruikt om het neuron te verbreken. In eerste instantie is het nuttig om precies bijhouden welke neuronen zijn uiteengevallen in individuele wormen om latere regeneratie te beoordelen. Bij het correct wordt uitgevoerd, laser axotomy produceert een kleine breuk in de neuron zonder significante schade aan de omliggende huid weefsel of andere neuronen (zie figuur 3). In bepaalde gevallen kan een klein litteken vormen rond de plaats van de verwonding. Recover de wormen door het verwijderen van het deksel slip in een directe opwaartse beweging, zorg ervoor dat de wormen blijven op de agarose pad. NIET Schuif de dekglaasje af. Daarna, snijd de pad om de wormen met naald-neus pincet en plaats het gedeelte van agarose op een vers gezaaide NGM plaat met OP50 8. Plaats 10 pi van de steriele M9 op het pad om de wormen te bevrijden van de kralen en agarose te verwijderen. 5. Score neuronen voor regeneratie Bereid agarose pad zoals beschreven in stap 2.2. Plaats wormen 3-5 &mu, L van polystyreen parels. Breng een dekglaasje aan. Dia's kunnen achter elkaar worden bereid, of anders de wormen kunnen worden voorbereid en de dia's bewaard in 10 cm cultuur gerechten, elk met een vochtige Kimwipe om de agarose vochtig te houden. Gebruik de 100X doelstelling om de verbroken neuronen te visualiseren. In veel neuronen, zal een neuronale stomp distaal van de snede site verborgen blijven. We maken gebruik van de aanwezigheid van dit overblijfsel als een aanwijzing dat de neuron inderdaad verbroken (figuur 4). De aanwezigheid van deze stam is het mogelijk om onderscheid te maken een neuron dat is uitgesneden en geregenereerd uit een die niet was afgesneden. Let op: zowel de distale en proximale stompen in eerste instantie terugtrekken na het snijden. Beoordeel regeneratie. Een verscheidenheid van parameters kunnen worden bepaald. Een eenvoudige test is of de benadeelde neuron heeft een groei kegel (figuur 4a) gevormd en geregenereerd, of niet (figuur 4b). Als alternatief kan de lengte van neurieten worden getraceerd en vergeleken. 6. Representatieve resultaten Als voorbeeld beschrijven we een karakterisering van de regeneratie van de γ-aminoboterzuur (GABA) motorische neuronen. Deze neuronen, die wonen in de ventrale zenuw snoer en de omtrek uit te breiden processen om de dorsale zenuw koord, zijn essentieel voor een goede motoriek 9. GABA neuronen kan worden gevisualiseerd met het uitspreken van een genetisch gecodeerd fluorofoor, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP), onder de controle van de unc -47 of -25 unc promotors (stammen EG1285 en CZ1200, respectievelijk, verkrijgbaar bij de C. elegans Genetic Center ). Mount L4-stadium wormen, zoals beschreven, flip de wormen, zodat de GABA neuronen op hun recht kanten naar boven en plaats de deksel slip. Snijd 1-3 van de achterste commissuren in elke worm, halverwege tussen de dorsale en ventrale snoeren. Vermijd het snijden commissuren dat kruis of fasciculate met andere commissuren, omdat deze later moeilijk te scoren. Recover wormen zoals beschreven. 18 tot 24 uur na een succesvolle axotomy, zullen de wormen hebben zich hersteld van de operatie en vertonen een normale motorische en eierleggende gedrag. Gooi wormen die zijn dood of ziek. Monteer de rest, zoals beschreven, en beoordelen van regeneratie. We meestal tot doel om minstens 30 cut neuronen per experimentele conditie te beoordelen. In oxIs12 dieren, zal doorgaans 60-70% van de afgehakte L4 GABA neuronen zijn begonnen met een groei kegel structuur, blijkt uit een verbreding van membraan bij de punt en de uitbreiding van een aantal neurieten takken, en gemigreerd van de snede site (figuur 4a). In veel gevallen zal de groei kegels zijn gemigreerd opnieuw te verbinden met de dorsale zenuw snoer, een aangrenzende neuronale commissuur, of de distale stomp. De resterende 30% van de neuronen zal ofwel geïnitieerd geen groei, de vorming van een stomp proximaal naar de site van axotomy, of zal hebben uitgebreid slechts kleine filopodia (figuur 4b). Figuur 1. De UV-gepulste laser axotomy systeem. Specifieke onderdelen zijn: (a) ND filters (b) puls selector (c) filter wiel hendel (d) optische pad schakelen hendel (e) laser sluiter en (f) verzwakker plaat. Figuur 2. Voorbereiden van een agarose pad. Ter voorbereiding op een agarose pad van de gewenste dikte, twee lagen tape (groen) worden geplaatst op twee dia's. Een dia is geplaatst tussen de eerste twee, en een daling van agarose wordt vervolgens toegevoegd aan de schone dia. Tot slot, is een kwart glijbaan loodrecht geplaatst om de eerste drie, wat resulteert in een pad, dat is de dikte van de twee stukken tape. Figuur 3. Vertegenwoordiger van GABA neuron axotomies. In een typisch experiment worden GABA neuron commissuren verbroken in het midden van de laterale aspect van de worm. Een afgehakte commissuur wordt getoond onmiddellijk vóór (links) en na (rechts paneel) axotomy. Alle beelden zijn gemaakt met een 100x olie doelstelling. Figuur 4. Representatieve resultaten van GABA neuron axotomies. 24 uur post-axotomy afgehakte axonen worden gescoord voor regeneratie. Een regenererende axon met een groei kegel (pijl) wordt getoond in (een), terwijl een niet-regenererende axon wordt gezien als een proximale stomp (pijl) in (b). De distale stomp van elke snede axon is te zien in elk paneel (pijlpunt) en is een indicatie dat de axon is verbroken.